Nature子刊│浙江大学李新/王毅开发新的探针，用于活细胞中超氧化物的荧光成像，具有超高特异性

超氧化物（O2−）是哺乳动物细胞中的主要活性氧。检测超氧化物对于理解氧化还原信号至关重要，但仍然具有挑战性。

2023年3月14日，浙江大学李新及王毅共同通讯在Nature Communications 发表题为“1,2,4,5-Tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity”的研究论文，该研究介绍了一类基于活动的传感探针。探针利用1，2，4，5-四嗪作为超氧化物响应触发器，可以模块化地连接到各种荧光团上，以调节探针灵敏度和发射颜色。这些探针提供对超氧化物的超特异性和超荧光响应，并以细胞器分辨的方式对各种细胞超氧化物水平进行多重成像。

值得注意的是，这些探针揭示了心肌缺血/再灌注损伤病理学中的异常超氧化物生成，并有助于建立高含量的超氧化物稳态介质筛选管道。一种这样确定的介质，coprostanone，被证明可以有效改善心肌缺血/再灌注损伤小鼠的氧化应激诱导损伤。总的来说，这些结果展示了1，2，4，5-四嗪系留探针作为在一系列病理生理环境中监测超氧化物的多功能工具的潜力。

活性氧（ROS）包括多种不稳定、氧化和寿命短的氧衍生物。它们相似的结构和反应性使得单个ROS的特异性检测极具挑战性。然而，为了准确阐明各种ROS在生理学和病理学中的多效性作用的分子机制，并将氧化还原信号转化为有效的治疗方法，必须开发强大的工具，专门检测感兴趣的 ROS，最好在具有理想时空分辨率的活细胞中。可能最重要的ROS是超氧化物（O2·−)。超氧化物由多种酶产生，其通过超氧化物歧化酶（SOD）突变产生H2O2并为其他ROS提供燃料以进行氧化还原信号。不平衡的超氧化物稳态引发氧化应激，这与衰老、癌症等的病因有关。鉴于超氧化物在氧化还原信号传导和氧化还原稳态中的关键作用，超氧化物的特异性检测长期以来一直是吸引持续研究的热点。

已经开发了各种方法来检测超氧化物，包括电子顺磁共振（EPR）自旋捕获技术、电化学传感器，分光光度测定，化学发光测定和荧光成像。在这些不同的方法中，荧光成像是最理想的，因为它与活细胞兼容，并允许以前所未有的时空分辨率直接原位追踪超氧化物动力学。鉴于细胞中超氧化物的不稳定性和区室存在，这一优势至关重要。为此，荧光探针二氢乙锭（DHE）及其线粒体锚定的类似物MitoSOX已成为生物学中检测超氧化物的最常用工具。蓝光发射DHE容易被超氧化物氧化，形成红色发光产物。因此，记录细胞中红色荧光的总强度已被常规用于评估细胞超氧化物的产生。虽然这种方法已经使用了大约二十年，但研究表明DHE也可以被其他ROS氧化形成红色发射产物，干扰超氧化物的成像。

进一步的研究确定2-羟基乙锭是通过超氧化物氧化DHE的特定产物，此后提出了高效液相色谱（HPLC）分析来检测超氧化物。该测定达到了所需的特异性，但不幸的是，以失去时空分辨率为代价。事实上，由于氧化是ROS家族的共同特征，基于氧化的超氧化物探针通常显示出次优的特异性。为了解决这个问题，开发了几种基于使用磺酰化和磷酸化探针检测亲核ROS的探针。尽管这些探针的开发提高了对超氧化物的选择性优于其他ROS；水解的趋势和生物亲核试剂的丰富存在仍然影响其特异性。开发具有理想特异性的荧光探针，用于细胞内超氧化物的时空成像仍然是一个艰巨的挑战。

该研究报告了一系列基于活性的传感（ABS）探针的设计和开发，用于以前所未有的特异性对活细胞中的超氧化物进行成像。探针是基于超氧化物的还原性质开发的，并利用从超氧化物到1，2，4，5-四嗪（Tz）的单电子转移作为响应机制。由于Tz固有的荧光淬灭能力，这些探针显示出对超氧化物的超荧光反应。通过调整探针反应性和发射颜色，以前所未有的空间分辨率实现了细胞超氧化物水平的多重成像。

设计用于检测超氧化物的基于四嗪的探针（图源自Nature Communications ）

鉴于探针的稳健性，该研究建立了一个高内涵的药物筛选模型，并确定了一种天然产物，以减轻缺血性心脏病病理学中氧化应激引起的损伤。研究人员设想，这些基于Tz的探针的特异性和超荧光反应将使其成为在一系列病理生理环境中跟踪超氧化物的非常有用的工具。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-37121-8

转自：“iNature”微信公众号

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