PNAS | 福建师范大学付新苗课题组揭示热休克增强氨基糖苷类抗生素杀菌效应的机理

细菌耐药是全球面临的重大公共卫生问题；发展增强现有抗生素杀菌效率的方法是应对细菌耐药的重要策略。

2023年3月14日，福建师范大学付新苗以独立通讯作者在PNAS 上发表题为“Heat shock potentiates aminoglycosides against Gram-negative bacteria by enhancing antibiotic uptake, protein aggregation, and ROS”的研究论文，该研究展示了短时间热休克能极大增强氨基糖苷抗生素对多种革兰氏阴性病原细菌的杀灭效果，其作用机理在于热休克刺激导致细菌跨膜质子动力势升高，从而增强了细菌对氨基糖苷类抗生素的摄入，后者结合其靶标核糖体，并和热休克一起诱导细菌胞内产生大量的不可逆蛋白质聚集和活性氧自由基（超氧化物），最终导致细菌死亡。另外，作者还借助红外辐射以及纳米光热材料结合808纳米激光，在铜绿假单胞菌感染小鼠皮肤伤口的模型上，展示了热休克增强氨基糖苷抗生素杀菌的效果，为推进该方法的临床转化研究奠定了基础。

细菌感染依然是导致人类死亡的重要因素。最近《柳叶刀》论文显示[1]，2019年全球与细菌感染相关的死亡人数依旧高达770万，占感染相关死亡人数的56.2%和总死亡人数的13.6%，其中与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌和克雷伯菌感染相关的死亡人数分别达到110万、95万、83万和79万。抗生素是治疗细菌感染的主要手段，但其面临严重的细菌耐药问题，往往导致抗生素治疗失败，给患者带来极大的痛苦甚至生命威胁。2022年的《柳叶刀》论文[2]指出， 2019年全球由细菌耐药直接致死的人数达127万，相关致死人数达495万，其中由大肠杆菌、克雷伯菌和金黄色葡萄球菌耐药直接致死的人数位居前三，分别达到21.9万、19.3万和17.8万人。发现新抗生素、增强现有抗生素的杀菌效率以及研发新型抗细菌感染的疫苗是应对细菌感染和耐药的主要研究策略。

氨基糖苷抗生素是一类由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，在治疗细菌感染中发挥了重要作用。例如由诺贝尔医学奖获得者Selman Waksman团队1943年发现的链霉素，作为世界上第一个抗结核药物挽救了无数结核病人的生命，至今仍然在抗结核临床中使用；原福建师范学院生物系王岳教授（Selman Waksman的研究生）在1966年领衔发现了庆大霉素的生产菌株并实现了其大规模生产和临床应用，挽救了无数国人的生命。但是，这一类抗生素由于其固有的毒副作用以及日益严重的细菌耐药问题而渐渐被放弃使用，目前主要用于治疗耐碳青霉烯类的细菌感染以及兽药。因此，发展增强氨基糖苷类抗生素杀菌效率的方法具有重要的临床意义：减少细菌耐药的产生，高效杀灭耐药菌，也能通过增效而减少剂量和治疗时间、实现降低毒副作用的目标。

国内外多个团队发展了多种增强氨基糖苷抗生素杀菌效率的方法，包括美国科学院院士James Collins团队2011年在Nature首次报导了糖类代谢物增效方法[3]，以及中山大学彭宣宪、彭博课题组发现的葡萄糖、丙氨酸增效方法[4]等。付新苗课题组也报导了多种基于物理效应的增效方法，包括低离子休克、快速冰冻等，此次在PNAS 上发表的热休克增效方法，由于其杀菌效果好、易于与纳米光热材料以及红外辐照联合使用，显示其广泛的临床应用前景。

作者首先尝试了多种物理方法，包括超声、紫外等，发现只有热休克（50℃或者55℃，5 min或3 min）能将多种氨基糖苷类抗生素的杀菌效率提高百倍到百万倍不等。其次，发现这种增效效应只对氨基糖苷抗生素有效，如妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素和链霉素等，对其它两种常用的杀菌型抗生素（喹诺酮类和β内酰胺类）无效。接下来，作者检验了热休克联合妥布霉素处理大肠杆菌持留菌、临床分离的大肠杆菌菌株等，均能有效杀灭，另外，也测试了多种病原细菌，发现对革兰氏阳性菌（例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）基本无效，对多种革兰氏阴性菌（如铜绿假单胞菌、志贺氏菌、沙门氏菌等）显示出较好的增效作用。特别重要的是，作者发现，针对临床上常见的耐药菌鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌，虽然妥布霉素的MIC高达8000 μg/mL以上，但热休克能让200 μg/mL妥布霉素就能达到2个数量级以上的杀菌效果，实现了杀灭耐药菌的目标。

进一步，作者展示了该联合处理方法能高效杀灭感染小鼠皮肤伤口的铜绿假单胞菌。首先，直接用红外辐照的方法加热感染细菌的小鼠皮肤伤口，观察到这种热休克也能增强妥布霉素杀灭铜绿假单胞菌的效果。其次，作者将一种特有吸收808纳米激光的光热纳米材料应用到小鼠皮肤伤口感染模型，证明这种条件产生的热休克也能增强妥布霉素的杀菌效果。

红外辐照产生的热休克增强妥布霉素杀灭小鼠皮肤伤口的铜绿假单胞菌（图源来自PNAS ）

作者系统研究了热休克增强氨基糖苷抗生素杀菌的作用机理。他们首先发现热休克能显著增强大肠杆菌对妥布霉素的摄取，同时，热休克也意外增强了大肠杆菌的跨膜质子动力势，暗示后者可能驱动了前者的产生。有趣的是，热休克联合妥布霉素处理后诱导大肠杆菌产生了不可逆的蛋白质聚集，而单一处理诱导产生的蛋白质聚集能被快速清除；同时，诸如甜菜碱、TMAO、Trehalose以及脯氨酸等化学分子伴侣能屏蔽热休克增强妥布霉素的杀菌效应，也能抑制不可逆的蛋白质聚集。这些结果证明了不可逆蛋白质聚集是热休克增强妥布霉素杀菌的重要因素。进一步，作者发现超氧自由基在热休克增效妥布霉素中也发挥了关键作用。多种抗氧化剂不仅能消除热休克的增效作用，也能大幅度降低热休克联合妥布霉素处理诱导产生的超氧自由基。有趣的是，作者针对不可逆蛋白质聚集和超氧自由基这两种致死因子，通过巧妙的设计证明了后者的产生依赖于前者，而前者的产生只是少量依赖于后者，从而进一步澄清了这两者在热休克增效杀菌中的相对贡献。

综合所有这些观察结果，作者提出了热休克增强氨基糖苷抗生素杀菌的机理模型。首先，热休克刺激导致细菌跨膜质子动力势升高，从而促进氨基糖苷类抗生素大量进入胞内；大量摄入的氨基糖苷抗生素和热休克协同作用，诱导细菌胞内不可逆的蛋白质聚集和活性氧自由基（超氧化物）形成，并最终导致细菌死亡（如下图所示）。

热休克诱导氨基糖苷对革兰氏阴性菌增强作用机制的模式图

此研究有助于深入理解氨基糖苷类抗生素的杀菌机理，也为开发基于热休克与氨基糖苷类抗生素联用治疗临床细菌感染的新方法、发展防控细菌耐药的新策略奠定了基础。

论文链接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2217254120

转自：“iNature”微信公众号

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