导读
神经病理性疼痛（NeP）是一种可明显影响患者心理健康和社会功能的疾病。由于复杂的病理机制，NeP的治疗具有挑战性。大黄素是一种天然蒽醌衍生物，具有良好的镇痛作用。然而，人们对其作用机制仍知之甚少。在这项研究中，我们使用蛋白质组学和代谢组学方法研究了大黄素在大脑皮层中镇痛作用的潜在机制。大黄素给药15天后，大黄素组的机械性缩足反射阈值（MWT）和热缩足反射潜伏期（TWL）值显著高于坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）组（p < 0.05），表明大黄素治疗可以逆转CCI诱导的痛觉过敏。大黄素处理在CCI模型中诱发了402种蛋白质（153种上调，249种下调）的表达变化，主要涉及磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、γ -氨基丁酸（GABA）受体信号通路、补体和凝血级联、环磷鸟嘌呤核苷/蛋白激酶G（cGMP/PKG）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和钙信号通路。同时，大黄素干预调节了CCI大鼠27种脑代谢产物（20种上调，7种下调）的丰度变化，这些代谢产物主要涉及碳代谢、氨基酸生物合成、磷酸戊糖途径和胰高血糖素信号通路。经过综合分析和蛋白质印迹验证，我们证明大黄素主要通过调节GABA能通路和PI3K/AKT/NF-κB通路来减轻NeP。
论文ID
原名：Proteomic and metabolomic approaches elucidate the molecular mechanism of emodin against neuropathic pain through modulating the gamma-aminobutyric acid (GABA)-ergic pathway and PI3K/AKT/NF-κB pathway
译名：蛋白质组学和代谢组学方法阐明大黄素通过调节γ-氨基丁酸(GABA)能通路和PI3K/AKT/NF-κB通路来对抗神经病理性疼痛
期刊：Phytotherapy Research
IF：6.388
发表时间：2023.01
通讯作者：王龙&王琛&陈鹏
通讯作者单位：西南医科大学&广州中医药大学&贵州中医药大学
实验设计
实验结果
1. 大黄素对CCI大鼠疼痛相关行为的影响
为了探讨大黄素对CCI大鼠疼痛相关行为的影响，我们进行了MWT和TWL值评价。CCI组和大黄素组的MWT和TWL值在术后第三天均显著低于假手术组（p<0.01），表明CCI操作导致严重的机械和热痛觉过敏（图1a–e）。大黄素给药15天后，大黄素组的MWT和TWL值显著高于CCI组（p<0.05），表明大黄素治疗可以逆转CCI诱导的痛觉过敏（图1a–e）。
图1 假手术组、CCI组和大黄素组在术前和术后第3、7、11和15天的MWT和TWL值（每组n=7）
（a）和（b）假手术组、CCI组和大黄素组的MWT值。（c）和（d）假手术组、CCI组和大黄素组的TWL值。与假手术组相比，* p < 0.05和** p < 0.01，与CCI组相比，# p < 0.05，## p < 0.01。
2. 大黄素对CCI诱导的脑蛋白异常表达的影响
我们进行了基于串联质量标签（TMT）的定量蛋白质组学研究，以揭示大黄素对CCI诱导的大脑蛋白质异常表达的影响。在我们的研究中总共获得了40824种肽，包括35532种独特的肽，最终鉴定了6054种蛋白质。根据FC值大于等于1.2和p值小于0.05的过滤标准，与假手术组相比，CCI组的脑样本中筛选了31个差异表达蛋白（DEPs），包括19个上调蛋白和12个下调蛋白（图2a，c）。与CCI组相比，大黄素组中筛选出402种DEPs，包括153种上调蛋白和249种下调蛋白（补充表S1，图2b，d）。亚细胞定位分析表明，大黄素组和CCI组之间的DEPs（E与C）主要位于细胞核、细胞质和质膜（图2e）。
图2 假手术组、CCI组和大黄素组脑样本中DEPs的火山图、聚类热图和亚细胞定位分析（每组n = 3）
（a）和（C）CCI组和假手术组之间DEP的火山图和聚类热图。（b）和（d）大黄素和CCI组之间DEP的火山图和聚类热图。（e）大黄素和CCI组DEPs的亚细胞定位分析。
表1 大黄素和CCI组之间DEPs的13个基于IPA的相互作用网络（每组n = 3）
大黄素组和CCI组之间DEP的基因本体（GO）注释在三个方面进行：细胞成分、生物过程和分子功能（图3a）。前五个显著富集的生物合成过程包括胶原生物合成过程的调节、细胞因子产生的正调节、胶原纤维组织、睾酮分泌的调节和睾酮分泌的正调节（图3b）。前五个显著富集的分子功能包括氧结合、肽酶抑制剂活性、内肽酶抑制剂、血红素转运蛋白活性和3-β-羟基-δ5-甾体脱氢酶活性（图3b）。然后，我们对大黄素和CCI组之间的DEPs进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，以探讨大黄素抗镇痛的潜在机制。结果表明，DEP主要参与多种疼痛相关通路，包括磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，补体和凝血级联，钙信号通路，环磷鸟嘌呤核苷（cGMP）/cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）信号通路等（图3c，d）。
我们使用Ingenuity pathway analysis（IPA）软件进行经典途径分析和相互作用网络分析。大黄素组和CCI组之间DEP的前五个富集的经典途径包括急性期反应信号、肝脏X受体（LXR）/维甲酸X受体（RXR）激活、真核翻译起始因子2（EIF2）信号、法尼醇X受体（FXR）/RXR激活和神经血管耦合信号通路（图4a）。我们通过功能分类构建了大黄素和CCI组之间DEP的13个相互作用网络（得分大于20，表1）。与疼痛相关的三个网络包括“细胞周期、细胞组装和组织、脂质代谢”、“神经疾病、器官损伤和异常、心理障碍”以及“心血管疾病、细胞间信号传导和相互作用、神经系统发育和功能”（图4b-d）。
表2 假手术组、CCI组和大黄素组脑样本中代谢物表达差异（每组n = 7）
图3 大黄素组和CCI组之间DEP的GO和KEGG途径富集分析（每组n = 3）
（a，b）大黄素组和CCI组之间DEP的GO富集分析。（c，d）大黄素和CCI组之间DEP的KEGG途径富集分析。
3. 大黄素对CCI诱导的脑代谢功能障碍的影响
为了揭示大黄素对CCI诱导的脑代谢功能障碍的影响，我们在假手术组、CCI组和大黄素组（每组n = 7）中使用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF/MS）进行了脑代谢组学分析。我们共鉴定出1421种代谢物，其中816种在正离子模式下鉴定，605种在负离子模式鉴定。我们使用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行多维统计分析（图5a–f）。在OPLS-DA模型中，CCI组和假手术组（C vs S）以及大黄素组和CCI组（E vs C）之间显示出明显的分离（图5c，d），表明大黄素可以部分改善CCI诱导的脑代谢功能障碍。置换检验表明，该模型具有良好的稳定性，没有过度拟合现象（图5e，f）。
图4 大黄素组和CCI组之间DEP的IPA生物信息学分析（每组n = 3）
（a）大黄素和CCI组之间DEP的经典途径分析。（b–d）大黄素和CCI组之间DEP的基于IPA的交互网络。
在OPLS-DA模型中，VIP > 1和p < .05用于确定显著差异的代谢物。与假手术组相比，CCI组的脑样本中筛选出57个差异表达代谢物（DEMs），包括33个上调代谢物和24个下调代谢物。与CCI组相比，大黄素组中发现了27种DEMs，包括20种上调代谢物和7种下调代谢物（表2，图6a）。我们在E vs. C和C vs. S之间发现了11种共同的DEMs（图6b）。此外，大黄素组大脑样本中的大黄素含量显著高于假手术组和CCI组（图6c），表明大黄素可以进入大脑。KEGG富集分析表明，大黄素和CCI组之间的DEM主要富集于癌症的碳代谢、胰高血糖素信号途径、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、磷酸戊糖途径和中枢碳代谢（图6c）。
图5 在正离子和负离子模式下，假手术组（S）、CCI（C）和大黄素（E）组脑样本的PCA评分图、OPLS-DA评分图和置换检验（每组n = 7）
（a，b）假手术（S）、CCI（C）和大黄素（E）组在正离子模式和负离子模式下大脑样本中的PCA评分图。（c）和（e）为正离子模式下大黄素组和CCI组之间的脑样本中的OPLS-DA评分图和置换检验。（d）和（f）为负离子模式下大黄素组和CCI组之间的脑样本OPLS-DA评分图和置换检验。
4. 大黄素组与CCI组DEPs及代谢物的相关性分析
为了探讨蛋白质和代谢产物之间的关系，我们对筛选的DEP和代谢产物（|FC| ≥ 1.2，p < 0.05）进行进一步的关联分析。Venn图显示了DEP和代谢产物共37条KEGG通路（图S1），前五条通路包括逆行内源性大麻素信号通路、cAMP信号通路、血小板活化、神经活性配体受体相互作用和产热（图S2）。热图中显示了50种疼痛相关DEMs和73种代谢产物的Pearson配对相关性，蓝色和红色表示负相关和正相关，与|r| ≥ 0.75和p < 0.05的相关性被构建成相关网络（图7a，b）。
图6 假手术组、CCI组和大黄素组（每组n=7）大脑样本中DEMs的表达和KEGG富集分析
（a）假手术组、CCI组和大黄素组的DEMs聚类热图。（b）C与S和E与C之间的DEMs的Venn图。（c）假手术组、CCI组和大黄素组大脑样本中大黄素的表达。（d，e）大黄素组和CCI组之间DEMs的KEGG富集分析。
5. 大黄素可调节GABA能和PI3K/AKT/NF-κB信号通路治疗神经病理性疼痛
根据蛋白质组学分析，大黄素诱导的关键蛋白的表达通过蛋白质印迹得到验证。结果表明，CCI抑制GABAA受体β2（GABRβ2）和GABRβ3的表达，同时促进VWF、p-PI3K、p-AKT和NF-κB的表达（图8）。相反，大黄素逆转了CCI诱导的GABRβ2和GABRβ3表达的抑制，以及CCI诱导促进VWF、p-PI3K、p-AKT和NF-κB表达（图8）。这些结果表明，大黄素通过激活GABA能信号通路和抑制PI3K-AKT-NF-κB信号通路减轻神经病理性疼痛。
图7 大黄素与CCI组DEM及代谢物的相关性
图8 假手术组、CCI组和大黄素组（每组n = 3）脑样本中关键DEMs表达的蛋白质免疫印迹分析。与假手术组相比，*p < 0.05和** p < 0.01。
讨论
NeP是健康的一个重要影响因素，其复杂的机制使药理学治疗具有挑战性。天然产品被认为是开发潜在镇痛药物的重要来源。大黄素对NeP的镇痛作用先前在多个动物模型中得到证实，其镇痛机制在外周神经节和脊髓水平上得到揭示。广泛的研究证实，皮层区域的结构和功能可塑性是疼痛发展的关键机制。在这项研究中，我们首次使用蛋白质组学和代谢组学方法阐明了大黄素在大脑皮层水平上的镇痛作用的药理学机制。
在我们的研究中，我们在CCI模型中验证了50 mg/kg大黄素的镇痛作用，据报道，大黄素在体内是安全的。我们发现，大黄素干预后，大脑皮层中大黄素含量显著增加，这表明大黄素可以穿过血脑屏障并在大脑中积累。蛋白质组学分析显示，大黄素处理在CCI模型中引起402种蛋白质（153种上调，249种下调）的表达改变。生物信息学分析表明，这些蛋白主要参与PI3K/AKT信号通路、γ- 氨基丁酸（GABA）受体信号通路、补体和凝血级联、cGMP PKG信号通路、MAPK信号通路、钙信号通路，这些都与神经炎症、神经元兴奋性和突触可塑性密切相关。同时，大黄素干预调节了CCI大鼠27种脑代谢产物（20种上调，7种下调）的丰度变化，这些代谢产物主要与碳代谢、氨基酸生物合成、磷酸戊糖途径和胰高血糖素信号通路有关。经过综合分析和蛋白质印迹验证，我们证明大黄素主要通过调节GABA能通路和PI3K/AKT/NF-κB通路来减轻NeP。
图9 大黄素通过调节GABA能信号通路和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的镇痛机制
伽马氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，GABA能突触对脊髓和大脑中疼痛信息的传递具有重要的抑制作用。GABA能途径开始于GABA从突触前末端的合成和释放，结束于通过与GABA受体的相互作用抑制突触传递。谷氨酸脱羧酶（GAD），尤其是GAD67（由gad1编码），是GABA合成的关键酶。据报道，用含有GAD67的病毒载体治疗可显著减弱NeP的几种动物模型中的泛相关行为。GABA受体是一类配体门控的氯离子（Cl）通道，由两个α亚基、两个β亚基和一个γ或δ亚基组成。GABAA受体的超极化抑制在很大程度上取决于K+-Cl共转运蛋白2（KCC2，也称为slc12a5）的活性，通过调节神经元氯化物浓度。周围神经损伤下调KCC2表达，将GABAA受体活性从抑制性改变为兴奋性，并通过Cl-平衡的正转变诱导病理性疼痛。在我们的研究中，大黄素处理的大鼠大脑中GABAA受体和KCC2的表达显著高于CCI模型（P < 0.05）。我们还发现，在大黄素干预后，GABA和GAD67的水平增加，L-谷氨酰胺和L-谷氨酸的含量减少，尽管差异没有统计学意义。因此，我们推测大黄素通过激活GABA能信号通路发挥其镇痛作用。
PI3K是一种脂质激酶，可以催化磷脂酰肌醇- 4，5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，它与含有蛋白质的普列克底物蛋白同源结构域相互作用，介导多种细胞功能。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K的关键下游效应物。PI3K/AKT信号通路在疼痛的发生和发展中涉及多种分子病理机制，包括中枢敏化和神经炎症。血管性血友病因子（VWF）是一种多聚糖蛋白，与炎症密切相关。最近的研究表明，CCI以时间依赖的方式诱导脊髓VWF表达的上调，VWF的抑制通过减少中枢血管生成、星形胶质细胞活化和神经炎症来减轻NeP。VWF可与糖蛋白Ib（GPIb）结合，从而激活PI3K-AKT信号通路。核因子-κB（NF-κB）是PI3K-AKT信号通路的一个重要下游效应子，它调节大量与炎症和免疫反应相关的基因。先前的研究表明，NF-κB的异常高表达发生在多个NeP动物模型的坐骨神经、背根神经节、脊髓和大脑中。抑制NF-κB表达可以通过下调瞬时感受器电位香草酸受体1和Nav1.3的表达，调节microRNA-183/硫氧还蛋白相互作用蛋白/NLR家族含3轴的pyrin结构域，以及抑制CX3CL1/CX3CR1信号传导，部分预防神经元兴奋性和炎症反应。在这项研究中，我们证明大黄素显著抑制了CCI大鼠大脑中VWF、p-PI3K、p-AKT和NF-κB的表达。因此，我们得出结论，大黄素通过抑制脑内PI3K/AKT/NF-κB信号通路发挥镇痛作用。
结论
总之，我们证明大黄素可以恢复CCI大鼠大脑皮层兴奋和抑制之间的平衡，以发挥镇痛功能（图9）。大黄素增强GABA能信号通路的抑制作用，并抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路，降低皮质兴奋性。我们的研究为发现靶向GABA能通路和PI3K/AKT/NF-κB通路的新药物治疗NeP提供了重要的见解。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36723382/
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