导读
溃疡性结肠炎（UC）是一种复发性炎症性疾病，没有特定的治愈方法或治疗方法。在此，我们研究了人参皂苷Rg3（Gin Rg3）对UC的潜在治疗作用和机制。我们构建了体外细胞炎症模型和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的UC小鼠模型。我们还使用Gin Rg3、MCC950（NLRP3抑制剂）、MSU（NLRP2激活剂）和粪便移植（FMT）干预模型。结果表明，Gin Rg3在体外和体内抑制NLRP3炎症小体激活、细胞焦亡和凋亡。Gin Rg3部分恢复了DSS在门或属水平上引起的肠道微生物群丰度变化。此外，Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体的激活而影响小鼠的肠道代谢。用Gin Rg3处理的肠道微生物群足以缓解DSS诱导的UC。总之，Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体激活和调节肠道微生物群稳态来减轻DSS诱导的UC。
论文ID
原名：Ginsenoside Rg3 Ameliorates DSS-Induced Colitis by Inhibiting NLRP3 Inflammasome Activation and Regulating Microbial Homeostasis
译名：人参皂苷Rg3通过抑制NLRP3炎症小体激活和调节肠道菌群稳态来改善DSS诱导的结肠炎
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：5.895
发表时间：2023.02
通讯作者：王沙龙
通讯作者单位：中南大学湘雅二医院
实验设计
实验结果
1. Gin Rg3抑制小鼠骨髓巨噬细胞（BMDMs）和结肠上皮细胞（CECs）中NLRP3炎症激活、细胞焦亡和细胞凋亡
首先，我们在体外研究了Gin Rg3对NLRP3炎症小体激活、焦亡和细胞凋亡的影响。在小鼠BMDMs和CECs被炎症诱导后，我们发现，LPS+ATP处理显著增加了细胞中ASC、GSDMD-N、NLRP3、pro-Caspase-1和Cleaved-Caspase1的蛋白表达水平，而Gin Rg3逆转了LPS+ATP对这些蛋白的影响；浓度越高，效果越明显（图1A）。同样，IF和ELISA结果表明，LPS+ATP处理增加了细胞中ASC和炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达，Gin Rg3可逆转这些指标（图1B、C和图S1A）。通过流式细胞术检测Gin Rg3对细胞焦亡的影响，结果表明，Gin Rg3可以逆转LTP+ATP处理的效果，导致Caspase-1和PI双阳性细胞数量显著减少（图1D和图S1B）。
图1 Gin Rg3抑制BMDMs和CECs的NLRP3炎症小体激活、细胞焦亡和凋亡
（A）BMDMs中NLRP3、Caspase-1、ASC和GSDMD-N的表达；Western blot检测CECs。（B）IF用于检测ASC的表达。（C）ELISA检测炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达水平。（D）流式细胞术检测Caspase-1和PI双阳性细胞。（E）电镜观察细胞焦亡。比例尺=500 nm。（F）TUNEL染色检测细胞凋亡。与对照组相比*P<0.05，与LPS+ATP组相比#P<0.05。
为了证实这种作用，我们通过透射电子显微镜观察了用LPS+ATP和高浓度Gin Rg3处理的细胞的微观结构。从图1E中可以看出，LPS+ATP处理的细胞显示出肿胀，在细胞膜上形成孔隙，细胞核集中，并形成泡状热体。这些症状在加入Gin Rg3后得到缓解。TUNEL染色显示，LPS+ATP处理促进了细胞凋亡，而Gin Rg3逆转了这一现象（图1F和图S1C）。总之，Gin Rg3抑制BMDMs和CECs的炎症，并干扰细胞的细胞焦亡和凋亡，高浓度Gin Rg 3比低浓度Gin Rg3更有效。
2. Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症的激活缓解UC
接下来，我们使用3%DSS在小鼠中诱导UC，并在体内评估Gin Rg3的抗炎作用（图2A）。上述数据表明，Gin Rg3可以抑制NLRP3炎症小体的激活。为了进一步探讨Gin Rg3是否发挥NLRP3抑制剂的作用来影响UC的过程，我们使用MCC950（NLRP3抑制剂）和MSU（NLRP2激活剂）进行进一步研究。如图2B所示（n=10），DSS处理导致小鼠体重减轻。Gin Rg3和MCC950的进一步处理都增加了体重，而MSU降低了体重。MSU+Gin Rg3处理减弱了MSU对小鼠体重的影响。疾病活动指数（DAI）的统计结果显示，DSS处理后DAI增加，而分别用Gin Rg3、MCC950、MSU和MSU+Gin Rg 3处理后DAI降低。用MSU+Gin Rg3处理的小鼠DAI低于用MSU处理的小鼠（图2C）。小鼠结肠的形态学观察和长度测量如图2D、E所示。DSS导致小鼠结肠缩短，而Gin Rg3和MCC950的进一步处理均增加了结肠长度。MSU处理缩短了小鼠结肠长度，MSU+Gin Rg3处理减弱了MSU对小鼠结肠长度的影响。HE染色进一步观察结肠组织形态学变化。如图2F所示，DSS处理小鼠的结肠有明显的炎性细胞浸润、粘膜坏死、透壁炎症、溃疡和隐窝细胞丢失。Gin Rg3和MCC950可减轻小鼠结肠损伤。MSU处理加重了结肠损伤，而MSU+Gin Rg3减轻了MSU对小鼠结肠损伤的影响。
图2 Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体激活减轻UC（n=10）
（A）实验设计。（B）小鼠体重变化曲线。（C）小鼠DAI曲线。（D，E）结肠的代表性图像和长度数据。（F）HE染色观察结肠组织的变化。比例尺=100μm。（G）IF检测结肠组织中E-cadherin、Occludin、Claudin1和Mucin-1的表达。（H）用ELISA检测右旋糖酐浓度。（G）Western blot检测结肠组织中NLRP3、Caspase-1、ASC和GSDMD-N的表达。（J）ELISA检测炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达水平。（K）流式细胞术检测Caspase-1和PI双阳性细胞。*与对照组相比P<0.05，与DSS组相比#P<0.05，与MSU组相比P<0.05。
为了探索潜在的分子机制，我们检测了结肠组织中相关蛋白的表达水平和血清中右旋糖酐的浓度。IF和ELISA结果显示，DSS处理降低了Claudin1、E-cadherin、mucin-1和Occludin的表达水平，并增加了血清中右旋糖酐的浓度。Gin Rg3和MCC950处理均逆转了DSS处理对这些指标的影响，而MSU处理具有相反的效果，MSU+Gin Rg 3处理削弱了MSU处理的效果（图2G，H和图S2A，B）。此外，我们还检测到结肠组织中的细胞焦亡相关指标。结果表明，Gin Rg3和MMCC950均逆转了DSS处理对ASC、GSDMD-N、NLRP3、pro-Caspase-1和Cleaved-Caspase-1蛋白表达水平、IL-1β和IL-18表达以及细胞焦亡的促进作用。MSU处理的效果与Gin Rg3和MMCC950处理的效果相反。MSU+Gin Rg3处理削弱了MSU的效果（图2I−K和图S2A）。这些结果与体外结果一致，表明Gin Rg3抑制NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡，并减轻了UC的症状。
图3 Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体的激活来调节肠道微生物群
（A）等级-丰度曲线。（B）Anosim分析箱型图。（C）花瓣图。（D）组间α多样性的差异箱图。（E，F）门和属水平的相对丰度直方图。（G，H）肠道微生物群的门水平热图和属水平火山图。
3. Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症的激活调节肠道微生物群
我们通过对粪便中细菌16S rDNA的焦磷酸测序，研究了Gin Rg3对肠道微生物群组成的影响。如图3A所示，等级-丰度曲线显示出所有种群的物种均匀度高，覆盖范围广。Anosim分析表明，组间差异大于组内差异，表明组间差异有意义（P=0.001）（图3B）。基于ASV的花瓣图显示，六组中有396个肠道微生物群。DSS处理增加了ASV的数量；进一步用Gin Rg3、MCC950和MSU处理降低了ASV的数量，而MSU+Gin Rg3处理增加了ASV，表明Gin Rg 3与肠道微生物群的多样性有关（图3C）。此外，我们使用Observe、Chao1、ACE、Shannon、Simpson和J指数来评估粪便微生物群落的细菌α多样性、丰富度和均匀性。如图3D所示，DSS降低了Observe、Chao1、ACE、Shannon、Simpson和J的指数，Gin Rg3和MCC950治疗进一步降低了这些指数。MSU和MSU+Gin Rg3处理增加了这些指标，表明Gin Rg 3可以通过抑制NLRP3炎症小体的激活来影响DSS诱导的UC模型中肠道微生物群落的微环境。
我们在门和属水平上进一步分析了细菌的丰度。六组中丰度较高的肠道微生物群如图3E、F所示。为了探讨Gin Rg3治疗对肠道微生物群丰富度的影响，我们分析了DSS和Gin Rg 3组在门和属水平上的丰度差异。在门水平，DSS处理增加了p_Cyanobacteria和p__Deferribacterota的丰度。Gin Rg3处理增加了p_Acctinobacterota和p_Verlucosbiota的丰度，并降低了p_Cyanobacteria和p_Patescbacteria的丰度（图3G）。而在属水平上，DSS处理增加了g_Rikenellacee_RC9__gut_group、g__Paraprevotella、g__Acetifactor和g_Chlamydia的丰度。Gin Rg3处理增加了g_Prevotellaceae_NK3B31_group、g_Paraprevotella和g_Chlamydia的丰度，并降低了g_Rikenellaceae_RC9_gut_group和g_Clostridium_sensu_stricto1的丰度（图3H）。这些数据表明，Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体的激活，部分恢复了DSS小鼠的肠道微生物群稳态。
图4 Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体的激活影响DSS小鼠的肠道微生物代谢
（A）样品组之间代谢物差异的PLSDA分析。（B）不同组之间代谢产物差异的热图。（C，D）门和属水平的肠道微生物群火山图。
4. Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体的激活影响DSS小鼠肠道微生物代谢
代谢变化被认为是肠道疾病的最重要标志之一。为了评估Gin Rg3重组肠道微生物群引起的代谢变化，我们使用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）对粪便样品中的不同代谢物进行非靶向代谢组学分析。sPLSDA分析结果显示各组间代谢物存在一定差异（图4A）。热图显示了前143种代谢物的相对丰度（图4B）。DSS处理后，小鼠粪便样品中的代谢产物（如柠檬酸、D-泛酸、2,4-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、2,6-二羟基苯酸、2,3-二羟基苯乙酸、N-乙酰丙氨酸、二乙基丙二酸、吡哆醇、3b-羟基-5-胆酸、N-acetylputrescine、大豆苷元、5-甲氧基水杨酸、对氨基马尿酸和香草酸）的丰度降低，同时，脱氧胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、N-乙酰-D-葡萄糖胺、肌氨酸、氨基甲酸乙酯和D-丙氨酸等代谢产物的丰度增加（图4C）。在用Gin Rg3进一步处理后，样品中代谢物如水杨酸盐、3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸酯、异丁香醇、甘草次酸、芥子酸和3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸的丰度降低。脱氧尿苷、水杨酰胺、7a-hydroxy-3-oxo-5b-cholanoic acid和次黄嘌呤的丰度增加（图4D）。这些数据表明，小鼠体内的一些代谢产物受到Gin Rg3的影响，由此可以得出结论，Gin Rg 3通过抑制NLRP3炎症小体的激活来影响小鼠肠道内的代谢。
图5 肠道微生物群与肠道代谢产物的相关性分析
（A）门水平相关分析的热图。（B）属水平相关分析的热图。
5. 关键肠道微生物群与肠道代谢产物的相关性分析
考虑到Gin Rg3对DSS小鼠的肠道微生物群和肠道代谢产物具有调节作用，我们想知道肠道微生物群与肠道代谢产物之间是否存在关系；从而进行Pearson相关分析。在门水平，我们对8种肠道微生物群的丰度和前22种代谢产物进行了相关性分析。结果表明，p_p__Bacteroidota的丰度与苯丙氨酸和谷氨酸呈正相关，与L-脯氨酸呈负相关。此外，p_p_Campilobacterota丰度与N-乙酰-L-色氨酸呈正相关，而p_p_Actinobacteriota丰度与异亮氨酸、L-异亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸呈正相关。p_p_Deferribacterota丰度与牛磺酸呈负相关，p_un_k_Unassigned丰度与2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸呈正相关。p_un_k_d__Eukaryota丰度与谷氨酸呈正相关，p_p_Chloroflexi丰度与牛磺酸呈负相关（图5A）。所有这些数据表明，在DSS小鼠模型中，某些门水平的肠道微生物群与肠道代谢产物有关。
同样，在属水平上，我们选择了7个肠道微生物群与前22名富集水平的代谢物进行相关性分析。结果表明：g__g__Muribaculaceae丰度与苯丙氨酸和谷氨酸呈显著正相关，与l -脯氨酸呈显著负相关；g_g_ Alistipes丰度与2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸呈负相关，g_g__Helicobacter丰度与N-乙酰-L-色氨酸呈正相关，g_g_Parabacteroides的丰度与苯丙氨酸呈正相关。此外，g_g_Muribaculum丰度与2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸呈正相关，g_g_Desulfovibrio丰度与异亮氨酸、L-异亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸呈正相关，g__g__Bifidobacterium丰度与石胆酰牛磺酸呈负相关（图5B）。总之，从结果可以推断，DSS小鼠模型中门和属水平的肠道微生物群丰度与某些代谢产物相关，这可能与UC的发生和调节有关。
图6 FMT减轻UC并抑制结肠组织中NLRP3的激活、细胞焦亡和凋亡（n=10）
（A）FMT实验的研究设计。（B）结肠的代表性图像和长度数据。（C）HE染色观察结肠组织的变化。比例尺=25μm。（D）IF检测结肠组织中E-cadherin、Occludin、Claudin1和Mucin-1的表达。（E）用ELISA检测右旋糖酐浓度。（F）Western blot检测结肠组织中NLRP3、Caspase-1、ASC和GSDMD-N的表达。（G）ELISA检测炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达水平。（H）流式细胞术检测Caspase-1和PI双阳性细胞。*与对照组相比P<0.05，与DSS组相比#P<0.05。
6. FMT（DSS-G）抑制UC结肠组织中NLRP3的激活、细胞焦亡和凋亡
最后，我们使用FMT确定Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体的激活而改变的肠道微生物群是否对UC具有治疗作用（图6A）。我们观察了用FMT处理小鼠的结肠组织。长度测量结果表明，DSS处理的小鼠的结肠变短、变厚，而DSSG处理的小鼠的结肠与未处理的小鼠相似（n=10）（图6B）。HE染色结果显示，DSS-处理的小鼠表现出明显的炎性细胞浸润、粘膜坏死、透壁炎症、溃疡和隐窝细胞丢失。DSS-G处理的小鼠结肠损伤得到缓解，这与未处理的小鼠相似（图6C）。形态学观察证实DSS-G组对UC的缓解作用。
为了进一步研究，我们还检测了结肠组织中相关蛋白的表达水平和血清中右旋糖酐的浓度。IF和ELISA结果显示，DSS治疗降低了Claudin1、E-cadherin、mucin-1和Occludin的表达水平，并增加了血清中右旋糖酐的浓度，而DSS-G逆转了DSS对这些指标的影响（图6D、E和图S3A）。此外，我们在结肠组织中检测到细胞焦亡相关指标。结果表明，DSS-G处理逆转了DSS处理对ASC、GSDMD-N、NLRP3、pro-Caspase-1和Cleaved-Caspase-1蛋白表达水平、IL-1β和IL-18表达以及焦亡的促进作用（图6F−H和图S3B）。这些结果与体内研究结果一致，表明DSS-G可以通过抑制NLRP3的激活来缓解UC。
讨论
溃疡性结肠炎（UC）是一种炎症性肠病。UC的临床表现为逐渐或突然便血、腹泻和腹痛，也可能包括急诊和大便失禁。体重减轻和发烧是严重疾病活动的典型特征。目前认为，肠道微生物群和粘膜免疫之间的失衡，导致肠道过度炎症，是UC的原因之一。人参皂苷Gin Rg3是人参的主要活性成分。它在多种疾病中具有显著的抗氧化应激和抗炎作用，并已被证明在某些炎症性疾病中具有治疗作用。然而，其在UC中的调节作用和机制尚未明确。本研究通过体外和体内实验研究了Gin Rg3对DSS诱导的小鼠UC模型的治疗作用及其机制。结果表明，Gin Rg3通过抑制NLRP3炎症小体的激活，进一步调节肠道微生物群的稳态，从而缓解UC。总之，我们的研究为Gin Rg3对UC小鼠模型的抗炎作用及其对肠道微生物群的调节提供了证据。
NLRP3是一种典型的炎症小体，可参与各种炎症性疾病的发生。研究表明，NLRP3可以促进结肠炎的产生，植物提取物如柚皮苷可以通过NLRP3缓解UC。最近的研究发现，Gin Rg3特异性抑制小鼠巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活，这种作用是通过抑制NEK7-NLRP3复合物的形成而介导的。然而，尚未报道Gin Rg3抑制NLRP3炎症小体激活介导的UC。在本研究中，我们通过结合细胞和动物实验研究了Gin Rg3对UC中NLRP3炎症小体激活的影响。我们的体外细胞实验结果表明，LPS+ATP处理增加了ASC、GSDMD-N、NLRP3、pro-Caspase-1和Cleaved-Caspase-1的蛋白表达水平，增加了ASC和炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达水平，以及Caspase-1与PI双阳性细胞的数量。此外，LPS+ATP处理导致细胞肿胀，在细胞膜上形成孔隙，浓缩细胞核，并在促进细胞凋亡的同时形成水泡热。Gin Rg3逆转了LPS+ATP处理对这些指标的影响。接下来，我们使用DSS诱导小鼠UC模型。结果表明，DSS导致小鼠体重减轻，结肠DAI增加，长度缩短，炎性细胞浸润明显、粘膜坏死、透壁炎症、溃疡和隐窝细胞丢失。同时，DSS处理降低了Claudin1、mucin-1、E-cadherin和Occludin的表达水平，并增加了血清中右旋糖酐的浓度、ASC、GSDMD-N、NLRP3、pro-Caspase-1和Cleaved-Caspase-1的蛋白表达水平、IL-1β和IL-18的表达以及Caspase-1与PI双阳性细胞的数量，这与体外实验结果一致。Gin Rg3和MCC950逆转了DSS对这些参数的影响。上述数据表明，Gin Rg3抑制NLRP3炎症小体的激活，从而减轻体内炎症，并在UC中发挥治疗作用。
由于NLRP3可以诱导IL-1β和IL-18的分泌，因此它也可以与肠道微生物相互作用。Liao等人发现，在原发性硬化性胆管炎的小鼠模型中，肠道失调通过激活NLRP3促进了肝病的进展。数据表明，UC的原因之一是肠道微生物紊乱。这表明NLRP3抑制剂可能通过调节肠道微生物群来缓解UC。我们假设Gin Rg3可能通过抑制NLRP3激活和恢复肠道微生物稳态来缓解UC。16S rDNA的结果表明，Gin Rg3处理进一步降低了DSS诱导小鼠肠道微生物的多样性。另一方面，Gin Rg3可以部分恢复DSS引起的门或属水平上肠道微生物群丰度变化。我们推测Gin Rg3可能会改变肠道细菌的结构，主要体现在Gin Rg 3在属水平上增加了有益细菌的丰度，如g_Prevotellacee_NK3B31_group和g_Paraprevotella，并减少了有害细菌的丰度（如g_Rikenellaceae_RC9_gut_group和g_Clostricum_sensu_stricto 1）。这些有益细菌的增加和有害细菌的减少缓解了UC。肠道代谢组学数据显示，Gin Rg3处理改变了DSS小鼠肠道中代谢产物的丰度，表明Gin Rg 3影响了小鼠肠道中的微生物代谢。对具有高丰度和肠道微生物群富集度的代谢产物进行的相关性分析表明，在门和属水平上分别有8种和7种肠道微生物，与富集水平前22位的一些代谢产物显著相关。这表明肠道微生物群结构可以在一定程度上调节粪便代谢产物水平。研究发现，肠道微生物群和人参皂苷与肠道内的转化和吸收密切相关。可以推测，NLRP3炎症小体引起的肠道炎症可能是胃肠道菌群紊乱所致，这也与一些肠道代谢产物的变化有关。Gin Rg3可以使肠道微生物群和代谢再次发生变化，但更具体的调控机制尚不清楚。
FMT是一种旨在恢复生态失衡的治疗方法。FMT已被证明可有效治疗Clostridioides difficile引起的炎症性腹泻。我们发现，在DSS模型中，Gin Rg3调节肠道微生物群丰度，并抑制NLRP3激活以缓解结肠炎。为了进一步验证该结论是否准确，我们进行了FMT。结果表明，Gin Rg3使DSS-G组的结肠长度和损伤恢复到接近对照组的水平。另一方面，Gin Rg3逆转了DSS对Claudin1、mucin-1、E-cadherin和Occludin表达水平的抑制作用，以及对右旋糖酐浓度、ASC、GSDMD-N、NLRP3、pro-Caspase-1和Cleaved-casase-1蛋白表达水平、IL-1β和IL-18表达以及细胞焦亡的促进作用。这些结果与DSS小鼠模型中的结果一致，表明Gin Rg3显示出良好的治疗效果。功能菌群在FMT中起着重要作用，这也表明Gin Rg3的调节机制与小鼠模型中的相同，它可能通过调节肠道微生物群的紊乱来治疗UC。基于上述结果，Gin Rg3有可能成为治疗UC的重要手段。可以推测，Gin Rg3可以抑制NLRP3炎症小体的激活，并调节肠道微生物的稳态，从而缓解UC症状，但具体的调节途径仍有待进一步研究。
结论
这项研究发现，Gin Rg3对DSS诱导的小鼠UC具有良好的药理活性，其机制可能与Gin Rg 3抑制NLRP3炎症小体激活后进一步调节肠道微生物群稳态从而改善肠道功能有关。总之，Gin Rg3在DSS诱导的UC模型中的抗炎活性突出了Gin Rg 3在UC临床治疗中的应用前景。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36752740/
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