激素性股骨头坏死（steroid induced osteonecrosis of femoral head，SONFH）是一种常见的进行性骨病，80%的患者会在1～4年内出现髋关节塌陷，最终需行人工关节置换，给社会家庭带来沉重负担[1]。SONFH的发生是由于免疫相关疾病过度使用糖皮质激素（glucocorticoid，GC）造成。GC诱导的骨内皮细胞凋亡可激活血栓形成并减少血管生成[2]。骨内皮细胞包括骨微血管内皮细胞（bone microvascular endothelial cells，BMECs）和内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs），在维持血管稳态以及股骨头血供中起着重要的作用。由骨内皮细胞受损引起的血管生成受损、细胞凋亡异常、血栓形成和脂肪栓塞被认为是SONFH的关键发病机制[3-8]。研究发现，骨细胞不能在距离血管超过100 mm处存活，所以学者们普遍认为血管发育总是先于成骨[9]。多项研究表明，血管内皮损伤与SONFH密切相关，来自SONFH患者的BMECs具有抑制迁移、血管生成受损和凋亡活性增加的特点[10-11]。另外，通过血管造影观察血管化大转子的骨移植治疗股骨头坏死能明显改善股骨头的血液灌注，并大幅改善患者髋关节活动功能[12]。因此，改善骨内皮细胞形态及功能是防控SONFH发生和发展的重要调节因子。
血管生成是支持SONFH修复的关键因素。研究发现使用普伐他汀和淫羊藿苷能促进血管新生，预防SONFH的发生[13-14]。银杏叶提取物能增加SONFH模型小鼠血管内皮细胞的活性，抑制甲强龙诱导的内皮细胞凋亡和功能丧失，逆转激素对磷酸化磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphorylated phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）和磷酸化内皮型一氧化氮合酶（phosphorylated endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS）表达水平的抑制，预防骨坏死[15]。本研究基于生物信息学分析筛选SONFH中与血管生成相关的差异表达基因，进一步通过基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，确定SONFH发病机制，以及核心基因的表达、功能、相互作用及信号通路，并进一步筛选靶向中药活性成分，为靶向修复骨内皮细胞和探索SONFH的治疗靶点提供新思路。
1 材料与方法
1.1 SONFH与血管新生相关的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选
从GEO数据库检索“steroid induced osteonecrosis of the femoral head”或“SONFH”获得GSE123568和GSE74089数据集。GSE123568包含10个对照样本和30个SONFH样本，GSE74089包含SONFH和对照各4个样本。检索Genecards数据库获得SONFH靶基因2174个。再通过检索“endothelial cells”和“glucocorticoid”，获得GSE25269数据集，包含2个对照组内皮细胞样本和2个地塞米松干预的细胞样本。使用Prel语言处理数据集，R软件的svg包对数据集去批次处理，通过limma包限定P＜0.05获得DEGs，制做热图进行可视化分析。
1.2 关键基因的筛选及GO和KEGG富集分析
将各数据集DEGs导入venny2.1软件，获得SONFH中与血管新生相关的关键基因。进一步使用David软件获取GO富集和KEGG通路相关信息。
1.3 关键基因的PPI网络构建与核心基因的筛选
通过STING平台和Cytoscape 3.9.0软件，深入了解SONFH中差异表达血管新生相关基因的内在联系。使用MCODE插件对基因进行聚类分析，使用CytoHubb插件获取核心基因。
1.4 鉴定与SONFH相关的核心基因
为了验证核心基因筛选的可靠性，使用GSE123568数据集鉴定选定的核心基因的表达水平。进一步使用CTD数据库验证核心基因与SONFH之间的相互作用关系。
1.5 靶向核心基因的中药活性成分筛选
CTD数据库是比较毒理基因组学数据库，采用CTD数据库搜索靶向作用于核心基因的中药活性成分（限定interactions≥2）。
1.6 分子对接
在TCMSP平台、ZINC数据库搜索与核心基因作用指数最高的中药活性成分的3D结构（mol2格式），在PDB数据库中输入核心基因Uniprot ID，下载相关靶蛋白的pdb格式文件，经PyMOL去水加氢后，使用Autodock vina1.1.2软件进行分子对接，再用PyMOL软件将结果可视化。
1.7 体外实验验证
1.7.1 细胞及试剂 人BMECs购自ICELL（上海）生物技术股份有限公司，白藜芦醇（resveratrol）、3-MA（PI3K抑制剂）购自MCE上海皓元生物医药科技有限公司，注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（methylprednisolone sodium，MPS，辉瑞制药有限公司），实验时将MPS溶于ECM培养基，3-MA和白藜芦醇分别溶于DMSO，原液浓度均为100 mmol/L，后续实验使用内皮细胞培养基（endothelial cell medium，ECM）稀释至合适浓度。
0.1%胰蛋白酶-EDTA、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司）；蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；Matrigel基质胶（BD Biosciences公司，美国）；Transwell小室（24孔培养板）、96孔培养板（Corning公司，美国）；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔抗多克隆抗体（1∶1000）、PI3K兔抗多克隆抗体（1∶1000）、Akt兔抗多克隆抗体（1∶1000）、磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗多克隆抗体（1∶5000）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔二抗（1∶5000）均为ImmunoWay公司产品。
1.7.2 白藜芦醇对MPS干预后BMECs增殖的影响
使用ECM培养制备BMECs混悬液，细胞数2×105个/mL，加入96孔板中，每孔100 μL，空白组不加细胞仅加100 μL ECM。过夜贴壁后，对照组加入ECM，处理组分别用终浓度25、50、75、100、200 μmol/L白藜芦醇＋20 μg/mL（终质量浓度）MPS[16]处理24、42、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8避光孵育2 h。酶标仪（BioRed，美国）检测450 nm处的吸光度（A），计算细胞活力。实验重复3次。
细胞存活率＝(A处理－A空白)/(A对照－A空白)
1.7.3 白藜芦醇对MPS干预后BMECs迁移的影响
（1）划痕实验：将细胞以2×105个/孔接种于6孔板内，分为6组：对照组、模型（10 mg/mL MPS）组、3-MA抑制剂（10 mg/mL MPS＋5 mmol/L[16]3-MA＋100 μmol/L白藜芦醇）组及白藜芦醇低、中、高剂量（10 mg/mL MPS＋50、100、200 μmol/L白藜芦醇）组。细胞在无血清培养基中饥饿8 h后，用200 μL移液管吸头刮去内皮细胞，洗涤未附着的细胞，每组给予相应药物，培养0、24 h后拍照，计算划痕愈合率。实验重复3次。
划痕愈合率＝(0 h划痕宽度－24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度
（2）Transwell迁移实验：分组和给药同划痕实验，消化细胞并用PBS洗涤3次去除血清影响，用无血清培养基调整细胞密度为1×105个/mL，每孔加入200 μL细胞悬液于Transwell小室内，24孔板内加入750 μL含10% FBS的ECM培养基。每组给予相应药物，孵育24 h后，Transwell小室用甲醇固定，0.1%结晶紫染色；随后用棉签去除每个小室内部未迁移细胞，倒置显微镜下观察。随机取3个视野计数迁移细胞并取均值，实验重复3次。
1.7.4 蛋白质印记分析 分组和给药同划痕实验，BMECs给予相应处理48 h后，通过RIPA裂解缓冲液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂1∶100）提取蛋白质，紫外分光光度计测定蛋白浓度并稀释浓度至10 mg/mL。加入5×上样缓冲液混合均匀，在95 ℃下加热5 min导致蛋白质变性。使用8% SDS-PAGE分离胶分离40 μg蛋白质样品，然后将其转移到PVDF膜上，用10%脱脂牛奶封闭2 h，然后一抗在随后的4 ℃下孵育过夜。之后，与其相应的二抗进行孵育。用电化学发光法观察条带。Image Lab 3.0软件用于量化条带灰度值。实验重复3次。
1.8 统计学处理
使用GraphPad Prism 9.0.0统计分析，实验数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SONFH与血管新生的DEGs的确定
数据集和平台信息见表1，通过GEO2R获得差异表达基因，以P＜0.05为条件筛选DEGs，GSE123568包含12 796个，GSE74089包含12 120个，Genecards包括2354个，其中GSE123568和GSE74089的数据经Perl语言处理合并及R软件（svg包）矫正后，使用ggplot2包将数据可视化，见图1，SONFH差异基因火山图及热图见图2。综合各数据集共获得SONFH的DEGs 963个，见图3-A。
同样筛选GSE25269（P＜0.05）数据集获得与血管生成相关的2373个DEGs，前50个DEGs热图见图3-B。
2.2 关键基因的筛选
将SONFH中与血管生成相关的基因定义为关键基因。将各数据集DEGs（P＜0.05）导入venny 2.1软件，获得118个SONFH中与血管新生相关的DEGs（图3-C）。其中74个在SONFH中表达上调，44个在SONFH中表达下调。
2.3 关键基因GO和KEGG富集分析
使用DAVID数据库进行关键基因的GO富集（图4-A、B、D）和KEGG通路富集分析，GO富集中生物过程主要涉及正调控血管生成、细胞黏附、炎症、细胞增殖、迁移和伤口愈合等；细胞组分主要涉及细胞外间隙、细胞外基质和胞外区；分子功能涉及蛋白质结合、血小板衍生生长因子和蛋白酶结合等。KEGG主要富集到PI3K信号通路、黏附斑信号通路、细胞外基质受体互作通路和Ras相关蛋白1（Ras-related protein 1，Rap1）信号通路等，关键基因与通路的桑基气泡图见图4-C。
2.4 关键基因蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）及核心基因筛选
将DEGs导入STRING平台，隐藏无连接的节点，获得包含102个节点和443条边的PPI网络，再导入Cytoscape，使用NetworkAnalyzer工具计算节点属性，节点大小对应度（degree）大小，见图5。再使用Cytoscape的MCODE插件寻找关键的子网络6个，见图6-A～F，其主要子网络（图6-A）涉及vegf激活的血小板衍生生长因子受体信号通路对细胞增殖、一氧化氮介导的信号转导调节、冠状血管形态发生和细胞黏附的正调节。
通过Cytoscape软件中的CytoHubba插件筛选关键基因中最大中心度（maximal clique centrality，MCC）评分前10位的基因，定义为核心基因。通过筛选依次为血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、白蛋白（albumin，ALB）、胰岛素（insulin，INS）、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、透明质酸的受体（CD44）、整合素β-1（integrin beta-1，ITGB1）、Thy-1膜糖蛋白（Thy-1 membrane glycoprotein，THY1）、血小板衍生生长因子受体β（platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFRB）、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶C（receptor-type tyrosine-protein phosphatase C，PTPRC）和胶原蛋白α-1（collagen alpha-1(I) chain，COL1A1），见图6-G。进一步对核心基因富集通路分析，结果显示通路主要富集到PI3K-Akt、黏附斑、Ras和Rap1信号通路等（图7），与关键基因富集通路大致相同。
2.5 SONFH血管新生相关的核心基因的筛选及鉴定
通过验证GSE123568数据集鉴定选定的10个核心基因的表达水平，发现核心基因表达均差异明显（P＜0.05，图8-A），尤其PTPRC、CD44、IGF1和VEGFA的差异最为显著，其中CD44、ITGB1和PTPRC表达上调，其余皆表达下调。进一步受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析显示PTPRC、CD44、IGF1、PDGFRB、ITGB1和VEGFA的曲线下面积（area under curve，AUC）值分别为0.897、0.837、0.777、0.770、0.767和0.703（图8-B）。
再使用CTD数据库验证核心基因与SONFH之间的相互作用关系（图9），结果发现COL1A1、IGF1、VEGFA和PTPRC与SONFH作用指数较高，提示可能为干预修复SONFH的重要靶点。
2.6 靶向核心基因的中药活性成分筛选
CTD数据库中靶向作用于核心基因的中药活性成分（interactions≥2）见表2。结果显示白藜芦醇、姜黄素、雌二醇和槲皮素等与核心基因相互作用指数较高，提示这些活性成分可能是作用核心基因促进血管新生修复SONFH关键药物成分。
2.7 分子对接
通过Autodock vina软件分子对接，显示靶向核心基因的主要中药活性成分白藜芦醇与VEGFA、PTPRC、ITGB1、PDGFRB、IGF1和CD44结合能均小于−5 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），结合稳定，结合能依次为−6.2、−6.1、−5.9、−5.6、−5.2和−5.3 kcal/mol。白藜芦醇与各蛋白形成氢键丰富，结构构象稳定，如与VEGFA通过氨基酸残基SER-9、GLY-42、GLY-41、LYS-103形成4个氢键；与PTPRC通过氨基酸残基SER-828/SER-829、ARG-834、GLY-833、HIS-797、GLN-872形成6个氢键；与PDGFRB通过氨基酸残基SER-40、SER-39、SER-77、ARG-19、ARG-37、PTR-1形成6个氢键；与ITGB1通过残基ARG-309、THR-310、SER-233形成3个氢键；与IGF1通过氨基酸残基GLY-19、GLN-15形成2个氢键；与CD44通过氨基酸残基SER-109、ILE-26、GLU-37形成3个氢键（图10），结果提示白藜芦醇有可能通过核心基因VEGFA、PTPRC、ITGB1、PDGFRB、IGF1和CD44发挥修复SONFH的作用。
2.8 白藜芦醇对MPS干预后BMECs的影响
2.8.1 对BMECs增殖的影响 CCK8检测显示，白藜芦醇浓度为100 μmol/L且作用48 h，能显著改善MPS对BMECs活性的抑制，见图11。
2.8.2 对BMECs迁移的影响 划痕实验和Transwell实验结果（图12）表明，基于划痕愈合率和细胞迁移数量两方面，模型组BMECs的迁移显著低于对照组（P＜0.05），白藜芦醇低、中、高剂量组BMECs的迁移明显高于模型组，白藜芦醇中剂量组明显高于3-MA抑制剂组（P＜0.05）。
2.8.3 对细胞蛋白表达的影响 Western blotting检测结果（图13）显示，与对照组比较，模型组PI3K/Akt/VEGF通路蛋白表达降低，其中PI3K表达水平降低显著（P＜0.05）；与模型组比较，白藜芦醇低、中、高剂量组中Akt、VEGF蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），白藜芦醇中、高剂量组PI3K蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05），而3-MA抑制剂组较白藜芦醇中剂量组通路蛋白表达明显降低（P＜0.05）。
3 讨论
SONFH是难治性骨科疾病，主要由血液供应中断和凝血系统功能障碍引起，导致骨细胞死亡、股骨头塌陷。GC的使用抑制了血管生成、骨修复和一氧化氮的代谢，通过调节血管活性介质如内皮素-1、去甲肾上腺素和缓激肽来诱导骨内股骨头动脉血管的收缩导致股骨头缺血，以及增加骨内压引起缺血，促进内皮细胞的凋亡，减少流向股骨头的血量[17-20]。骨内皮细胞不仅可以形成微血管系统，为发育中的骨骼提供营养，还可以在体外和体内增强间充质干细胞的成骨分化，促进骨修复。因此，寻找SONFH中与血管生成相关的基因，在诊断和修复SONFH方面具有重要作用。
本研究分析了公共数据库中可用的微阵列数据集GSE123568、GSE74089、GSE25269和Genecards数据库，获得SONFH的DEGs共963个，血管生成相关DEGs共2373个，获得SONFH中与血管生成相关的关键基因118个，其中74个在SONFH中表达上调，44个在SONFH中表达下调。这些基因主要富集于正调控血管生成、细胞黏附、炎症、细胞增殖和迁移、伤口愈合等，大部分作用于细胞质和核质。有研究证实细胞因子IL-10和TNF-α与SONFH的发生有关[21]。据报道，促红细胞生成素通过刺激VEGF的表达来促进血管生成，以保护股骨头免受GC诱导的骨坏死的侵害[22-23]。细胞黏附相关蛋白Rap1在SONFH中下调，对股骨头内微血管内皮细胞黏附及迁移造成障碍，未能对受损血管内皮及时修复，加速骨坏死进程[24]。此外，KEGG富集分析主要涉及PI3K-Akt信号通路、黏着斑信号通路、细胞外基质受体互作通路和Rap1信号通路等。参与这些途径的大多数基因都被上调了。PI3K-Akt是一个重要而复杂的信号通路，其在干细胞调节的细胞存活、增殖、迁移和血管生成中起着核心作用。激活PI3K-Akt信号通路可显著增强各种组织中内皮细胞的功能[25]。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一种非受体蛋白酪氨酸激酶和支架蛋白，可介导许多细胞功能，包括黏附、迁移和侵袭。FAK抑制剂可减少滑膜成纤维细胞的侵袭和迁移，因此，抑制FAK可能有助于改善在SONFH发展中的骨髓水肿和滑膜炎[26]。黏着斑与细胞生长、形状和运动有关。研究表明，黏着斑是股骨头坏死后未成熟关节软骨中显著丰富的生物学途径[27]。本团队前期研究发现非创伤性股骨头坏死可能与信号通路Rap1/PI3K/Akt受到抑制导致其表达下降所引起的血管内皮损伤有关[24]。细胞外基质受体互作通路与血管生成、软骨生成和软骨退化有关[28]，且在股骨头坏死的髋软骨中显着富集[29]。本研究结果提示PI3K-Akt信号通路、黏着斑和Rap1信号通路等参与了SONFH的发病机制。
10个核心基因是VEGFA、ALB、INS、IGF1、CD44、ITGB1、THY1、PDGFRB、PTPRC和COL1A1。这些核心基因都可能在SONFH发生和发展中起到重要作用。VEGFA基因位于染色体6p31.3[30]，是编码血管内皮生长因子的成员，与VEGF受体在胞外结合，刺激细胞内酪氨酸激酶，促进内皮细胞增殖，增加血管通透性。已有研究将VEGFA启动子区域内的多个遗传多态性与非创伤性SONFH的疾病状态联系起来。VEGFA是血管生成的关键介质[31]，诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡并诱导血管通透。使用VEGF受体拮抗剂可以在动物模型中阻断血管生成并诱导SONFH[32]。IGF1调控细胞生长、分化，如刺激成骨细胞和内皮细胞的增殖，促进组织再生与修复。IGF1可逆转地塞米松对PI3K-Akt信号通路的抑制，并抑制其下游叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1，FOXO1）的表达，进而治疗SONFH[33]。CD44抗原是透明质酸（hyaluronic acid，HA）的受体。通过其与HA和其他配体（如骨桥蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶）的亲和力来介导细胞与细胞、细胞与基质的相互作用，其与HA的结合在细胞迁移中起作用。PDGFRB通过促进周细胞和平滑肌细胞向内皮细胞的增殖、迁移和募集，在血管发育中起至关重要的作用[34]。PTPRC是抗原受体激活T细胞所需的蛋白质酪氨酸-蛋白质磷酸酶。有研究发现微重力环境中的小鼠股骨头出现了骨吸收，检测髓腔分离的细胞显示早期间充质干细胞造血分化的基因PTPRC的表达显著下调[35-36]。COL1A1在SONFH模型兔中的表达被抑制，使用葛根素后COL1A1的表达升高，且SONFH模型兔的成骨能力增加[37]。目前ALB、INS、CD44和THY1等核心基因在骨坏死中的作用机制尚不清楚，有待于进一步研究。
通过GSE123568数据集鉴定，发现核心基因尤其是PTPRC、CD44、IGF1和VEGFA的表达差异最为显著。ROC分析显示PTPRC、CD44、IGF1、PDGFRB、ITGB1和VEGFA的AUC值均大于0.7，具有较大可能性成为SONFH潜在生物标志物，Ma等[38]在1项汉族人群VEGFA与SONFH的遗传关系的研究中，VEGFA单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）基因型rs2010963与SONFH显著相关。通过CTD数据库验证核心基因与SONFH之间的相互作用关系，发现COL1A1、IGF1、VEGFA和PTPRC与SONFH作用指数较高，提示可能为干预修复SONFH的重要靶点。目前已有通过VEGFA防治SONFH的研究，有研究发现促红细胞生成素通过刺激VEGFA的表达，可保护股骨头免受GC诱导的骨坏死的侵害[39]。CTD数据库筛选靶向核心基因的中药活性成分，发现白藜芦醇、姜黄素、雌二醇和槲皮素等与核心基因相互作用指数相对较高，为防治SONFH提供了新的方向。
分子对接显示白藜芦醇与SONFH中与血管新生有关的核心基因结合稳定，并通过体外细胞实验证实白藜芦醇能显著上调本研究筛选的核心基因VEGFA及PI3K/Akt信号通路的表达水平，表明白藜芦醇对激素干预的BMECs的损伤具有修复作用，主要通过激活PI3K/AKT/VEGF信号通路提高BMECs的活性并促进细胞的迁移。也有研究发现，白藜芦醇可以改善SOFNH兔模型中的骨骼血液供应，以保护血管内皮细胞并减少血栓形成[40-41]。研究表明，姜黄素可通过抑制Janus激酶1/2（Janus kinase 1/2，JAK1/2）-信号转导和转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）途径抑制SONFH模型小鼠细胞M1极化来防止炎症介导的骨细胞凋亡[42]，与本研究筛选结果一致，说明姜黄素有很大潜能成为临床治疗SONFH药物的新选择。
4 结论
通过生物信息学分析鉴定了SONFH血管新生相关的核心基因和通路，尤其是PTPRC、IGF1、VEGFA、ITGB1、PDGFRB和CD44核心基因和PI3K信号通路、黏附斑信号通路、细胞外基质受体互作通路和Rap1信号通路等，它们可能与SONFH发病密切相关；筛选出白藜芦醇最有可能成为预防或逆转骨坏死的潜在药物，并进行了实验验证。本研究有助于理解血管新生在SONFH发病机制中的作用，为寻找具有SONFH诊断或治疗价值的生物标志物的相关大样本研究提供参考依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：肖 振，李盛华．激素性股骨头坏死血管新生相关基因的鉴定及其靶向中药成分筛选验证 [J]. 中草药, 2023, 54(5):1526-1539.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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