金大勇院士等AFM综述：剑指类器官！

以下文章来源于EngineeringForLife ，作者EFL

在体外3D模型中用于个性化医疗和药物筛选的多细胞球状体和类器官中是非常有前景的。它们在体内复制了人体器官的结构和功能特征。微流控技术和微纳制造可以满足球状体和类器官日益增长的研究兴趣中工程方法的高要求。澳大利亚悉尼科技大学金大勇院士和中国科学院上海硅酸盐研究所的吕宏旭教授团队在国际期刊《Adv Funct Materials》杂志上发表题为“Advances in Spheroids and Organoids on a Chip”的综述文章，对球状体和类器官进行了比较介绍。主要说明了球状体和类器官技术如何通过时空控制、机械线索建模、高通量分析、共培养、多组织相互作用、生物传感和生物成像集成来促进它们的建立、扩展和应用。最后展望了开发单芯片球体和类器官技术的潜在机遇和挑战。

与细胞粘附在平板表面的2D单层培养相比，3D细胞培养允许细胞生长并与各个方向的环境相互作用，从而模拟体内的特异性和稳态。因此，3D细胞模型在细胞分化、耐药性和代谢以及刺激-反应等方面都与真实组织仍然具有较高的相似性。多细胞球状体和类器官是3D细胞培养的主要代表性模型。球状体通常是指圆形和致密的细胞聚集，通常由单一类型的细胞（上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞等）组成。它们可以通过细胞系、单细胞或组织的隐窝形成（图1）。类器官是高度有序和极化的三维结构，其中一些具有典型的管腔（胃肠道类器官、肺类器官等）。迄今为止，已通过aSCs、iPSCs或ESCs成功建立了超过15种类器官，如脑类器官、视网膜类器官等。类器官目前被广泛应用于器官形成、发病机制、药物发现、个体化医学、疾病模型等领域。

本文以片上技术的特点为指导，对芯片上球状体和类器官的研究进展进行了对比综述。如图2所示，一般来说，微流控技术可以从以下几个方面促进球状体和类器官的建立：1)时空控制；2)机械线索建模；3)高通量分析；4)多组织或器官的相互作用；5)生物传感和生物成像的集成

1. 时空控制

1)化学信号：如图3A所示是一个用于暴露于局部形态源的微流控装置，水凝胶形成的屏障可以将细胞室与外灌注通道分离。球体研究主要集中在药物和营养浓度的空间控制，最常见的策略是将浓度梯度发生器与微孔阵列或微液滴阵列相结合（图3B）。球状体和芯片上的类器官技术支持时间顺序的药物组合,如图3C所示，人胰腺导管肿瘤类器官在微孔层中培养，并由顶部通道中的培养基进行冲洗。2）形态学指导：如图3D所示，芯片上技术在支架形状的引导下形成了毫米鳞状的管状肠样器官，具有隐窝和绒毛状结构域。图3E显示，在肠上皮细胞培养过程中，工程隐窝绒毛状胶原支架可以形成伽马分泌酶抑制剂DAPT和WNT的垂直浓度梯度。如图3F所示，几何限制的人iPSC细胞在空间模式下表现出不同的分化。如图3G所示，明胶牺牲法有助于形成晶状体上皮球状体的空心核心。图3H提出了一种简单的方法，在单个芯片上生成梯度大小的乳腺肿瘤球状体。

2. 机械线索建模

1）流体剪切力：如图4A所示，在血流刺激下培养的血管化肾类器官比在静态培养下生长出更多的足细胞和小管腔室，极性增加。与静态培养相比，微孔中受血流刺激的人胰岛表达了更多的毛发状微绒毛、细胞连接更紧密和胰岛素分泌更多（图4B）。图4C用微管建立胃模拟管腔血流。4D是由齿轮电机系统驱动的级联微型搅拌器与脑类器官的培养物集成在一起。2）张力和压缩：图4E设计了一个包含介质通道和压力通道的结肠肿瘤类器官芯片来模拟肠道蠕动。利用柔性的PDMS/PAAm开发了一种用于NIH 3T3成纤维细胞球状体的可伸缩微阵列(图4F)。3)力学测量：图4G开发了一种上皮管腔芯片装置，根据PDMS衬底的变形来测量管腔压力和张力。微流控芯片可以帮助封装小鼠结肠肿瘤CT26细胞内切酸胶囊（图4H）。如图4I所示，将HEK293T球状体引入PDMS流式细胞仪，研究其在水动力应力下的Young模块。

3. 高通量分析

1）微孔：微孔是在3D培养中应用最广泛的工具，特别是对球状体。如图5A所示，PEG水凝胶微孔阵列是为胃肠道类器官的大规模悬浮开发而设计的。2）液滴和微珠：液滴技术是微流体技术中最具代表性的工具之一，它可以以高通量的方式产生液滴或微珠。如图5B所示，在4°C条件下，在流动聚焦芯片上产生纯基质凝胶液滴，然后在37°C条件下孵育半小时。3）微柱：微柱可以很好地用于球状体和类器官的高通量发展。如图5C所示，在分化培养基的灌注下，接种在微柱间的诱导多能干细胞聚集在一起，然后分化为肝类器官。将凝胶包裹的人诱导多能干细胞细胞植入每个微柱的顶部，然后插入微孔中进行独立培养（图5D）。如图5E所示，使用微流控室中的PDMS微柱捕获小鼠肠样。4）表面声波：表面声波技术已广泛应用于细胞排列的微流体技术中。如图5F所示，指间传感器通常集成到芯片中，在细胞悬浮室中产生顶电场。

4. 共培养和多组织相互作用

1）与HUVECs共培养进行血管化：如图6A所示，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）可以接种于侧向通道上。如图6B所示，优化了血管和结肠类器官的ECM和培养基。2）与免疫细胞共培养：肿瘤微环境中的肿瘤免疫相互作用控制肿瘤进展和药物反应。如图6C所示，将来自小鼠的CT26肿瘤球状体接种在芯片上，其中包含自体淋巴细胞和髓系细胞。图6D设计了一个微流控芯片来研究针对乳腺肿瘤球状体的自然杀伤（NK）细胞。3）与基质细胞共培养：图6E提出了一种使用液滴-毛细管锚点的球形顺序合并策略。图6F使用了一个基于印章的微流控芯片来研究乳腺肿瘤球状体（在孔中）和脂肪细胞（在表面上）之间的相互作用。如图6G所示，在芯片上设计了单元格的单向通信。

5. 生物传感和生物成像集成

1）电化学传感器：电化学传感器已广泛应用于pH、氧、如葡萄糖等生化参数的监测。图7A设计了一个具有代表性的装置来连续监测芯片上的人结肠肿瘤球状体分泌的乳酸和葡萄糖。为了提高灵敏度和选择性，图7B设计了适配体功能化电极来捕获肌酸激酶-MB（受损心脏类器官分泌的生物标志物）。图7C使用了一个自卷制的生物传感器阵列来多重记录心脏球状体表面的场电位，甚至是钙成像。2）片上成像：球形和类器官芯片技术的另一个进步是生物成像的简单集成。图7D描述了对3D组织（乳腺肿瘤球状体）的片上清除技术。如图7E所示，一个无透镜成像系统与芯片上的球状体集成。如图7F所示，高折射率波导芯片可以为荧光分子提供较强的倏逝光。

随着球状体和类器官冠状体技术的快速发展，作者展望了这一领域的三个未来方向，如图8所示。首先，芯片上的复杂性和系统性将大大增加。微环境的高复杂性协同允许体内稳态。特定的球状体或类器官，如心脏或胃肠道区域需要相关的机械刺激。同时，传统的球形形态被空间控制引导下的器官样大规模结构所取代。其次，通过芯片上的球状体和类器官，可以为芯片上的体系提供一个快速和简洁的策略。人体复杂的功能和活动依赖于各种器官之间的信号通路和激素刺激回路，这保证了内稳态。球形/类器官模型的一个重要应用是药物筛选，它通常涉及药代动力学的定量和ADME的预测（吸收、分布、代谢和排泄）。与片上器官技术相比，基于球状体和类器官的片上体技术可以促进高通量整合和分离类器官水平分析，主要有利于药物筛选的大规模评价。最后，新兴的3D和4D生物打印技术允许在细胞排列、生物材料控制、形态学指导和批量生产方面建立更复杂和大规模的模型。先进的成像技术，如晶格光片显微镜、超分辨率显微镜、膨胀显微镜和芯片上成像技术，将有助于深入了解纳米尺度上的细胞进展。

文献来源：

https://doi.org/10.1002/adfm.202215043

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