Anal. Chem.：超尺寸配体实现DNA高选择性识别：探测极性决定的DNA三核苷酸重复序列折叠结构及奇偶依赖性

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《背景介绍》

三核苷酸重复序列(TNRs)异常扩增引起的结构多态性与神经退行性疾病密切相关。近日，浙江师范大学邵勇研究员课题组以“All-or-None Selectivity in Probing Polarity-Determined Trinucleotide Repeat Foldings with a Parity Resolution by a Beyond-Size-Matching Ligand”为题在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.2c04810）报道了TNRs结构高选择性识别的研究成果。

研究的主要内容

DNA双链结构中核苷酸的构象在配体结合、酶识别、DNA转录/翻译中发挥着重要作用。CNG和GNC(5'-3'，N=T, A, G, C)三核苷酸重复序列(TNRs)异常扩增认为是引起神经退行性疾病的重要原因，在复制过程中，这些TNRs可以形成发夹结构，影响其后的基因表达，表达程度依赖于碱基N的种类、重复序列极性、及重复序列长度决定的发夹结构折叠多态性及稳定性。这种发夹结构的基本特征为CG/GC碱基互补配对及N-N错配的交替（图1）。已经发现TNRs的发夹折叠依赖于重复序列的奇偶性。也就是说，奇数的重复序列形成的发夹结构与偶数的重复序列形成的发夹结构是不一样的,我们称之为PaDF效应。此外，TNRs的折叠结构也与链的极性相关。已有研究表明，N-N错配甚至某些G-C碱基对的折叠构像与TNRs的极性密切相关。例如，最近，Weber及其同事从理论上研究表明，对于5'-GTC-3'重复序列形成的发夹结构（缩写为GTC），除了末端T-T错配（图1，红色背景）采用比中间（绿色背景）的更明显的螺旋外构象外，末端的5'-G-3'-C碱基对也比中间的5'-G-3'-C碱基对更大程度地向螺旋外翻转（图1）。然而，对于极性反转的5'-CTG-3'重复序列形成的发夹结构（缩写为CTG），末端的5'-C-3'-G碱基对和T-T错配与中间的碱基对（蓝色背景）的构象差异要小得多（图1）。因此，无论是5'-GTC-3'重复序列还是5'-CTG-3'重复序列，形成的发夹结构关闭loop环的沃森-克里克碱基对都是5'-C-3'-G，这与早期其他研究者的结果一致。这种极性依赖的折叠结构多态性，我们称之为PoDF效应。因此需要发展有效的方法来识别PaDF和PoDF决定的TNRs发夹结构多态性。

目前TNRs发夹结构研究的荧光方法主要有两种。一种是通过荧光团共价标记修饰，采用FRET策略研究TNRs的发夹折叠结构。另一种是发展特异性配体，设计与N具有互补氢键结合的小分子配体来识别TNRs。由于采用了非共价方法，在靶向及细胞研究方面有应用前景。例如，采用triaminotriazine-acridine conjugates和pyrrolo-quinoline fused heterocycles识别错配的T碱基，hydroxylated porphyrins和aminonaphthyridines识别C碱基，napthyridine-azaquinolone conjugates识别A碱基等。大多数配体具有与碱基相当的几何尺寸，并且可以无差别地崁入结合TNRs中的所有N-N错配，我们称之为尺寸匹配配体，即SM配体。因此，这些SM配体无法实现具有PoDF/PaDF偏好的TNRs折叠结构的高选择性识别。为解决此问题，我们发展了超尺寸匹配配体，即BSM配体。由于BSM配体的几何尺寸比碱基大，不能崁入结合到TNRs中构像为螺旋内的N-N错配，而能通过互补氢键作用结合到构像为螺旋外的N-N错配，可以实现高选择性识别PaDF/PoDF决定的TNRs发夹结构的多态性。本成果以GTC和CTG TNRs为例，采用伪金丝桃素(Pse)为BSM配体(图 1)，发现GTC TNRs能结合Pse，点亮其荧光，而CTG TNRs无任何结合作用，实现了PaDF/PoDF的高选择性TNRs识别。

我们通过荧光、圆二色谱(CD)、熔融温度（Tm）、电泳等技术研究了Pse识别GTC和CTG的特异性，观察到了Pse荧光的PaDF和PoDF效应（图2A）。设计了TNRs重复序列仅位于靠近loop环位置（L-GTCn和L-CTGn）和靠近stem末端位置（S-GTCn和S-CTGn）的发夹结构，证实了Pse仅能与GTC发夹结构中螺旋外的T-T错配结合，而与其它T-T错配没有结合作用，表明设计的BSM探针的超尺寸效应。

此外，为了探索基于GTC TNRs的BSM配体的典型应用，对编码3-酮还原酶的erg27基因的序列进行了无标记单核苷酸多态性（SNP）分析。苯丙氨酸412残基的TTC密码子可变异为GTC密码子而生成缬氨酸残基，这种变异可调节麦角甾醇的生物合成。我们使用在3'端具有5'-GTC-3'三核苷酸的序列为探针（P），与靶标序列的5'端为野生的TTC密码子（WTTC）及GTC、ATC和CTC突变体（MGTC、MATC和MCTC）的序列杂交。我们发现只有GTC突变体能有效点亮Pse荧光，而其它突变体仅产生弱的背景荧光（图3）。这些结果表明了BSM配体在选择性突变分析中的潜在应用。

转自：“NANO学术”微信公众号

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