Anal. Chem. | 席夫碱化学耦合类儿茶酚氧化酶反应作为超灵敏生物传感的一种通用型传感模式

以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者Nanozymes

基于纳米酶的分析化学是合理设计用于环境监测、临床诊断和食品分析的生物传感器的重要工具。尽管研究者们对基于纳米酶的生物传感器(如免疫传感器和自适应传感器)表现出极大的研究兴趣，但是设计检测分析物所需的理想型生物传感器所需的传感模式和催化性能仍具有挑战性。为此，西北农林科技大学食品快速检测课题组王建龙教授团队联合合肥工业大学沈益忠副研究员等设计并构建了席夫碱化学与新型类儿茶酚氧化酶纳米酶(CHzyme)耦合的级联反应，该反应具有两点主要的优势：

(1) 与CHzyme的类氧化酶活性相比，催化性能提高了近2倍。

(2) 通过级联反应的信号转导增加输出信号的可设计性。

随后，提出并被全面研究了基于席夫碱化学耦合CHzyme催化反应的底物传感，包括催化底物传感模式、竞争底物传感模式和生成底物传感模式，分别可应用于环境监测、食品分析和临床诊断。更有意义的是，生成底物传感模式被成功应用于构建检测克伦特罗（CLL）的级联反应偶联比率荧光免疫分析方法，该方法与传统的酶联免疫吸附试验相比，检测灵敏度提高了15倍。本文的通讯作者为王建龙教授和沈益忠副研究员，第一作者为2020级硕士研究生李跃春。

团队通过学习天然儿茶酚氧化酶的结构，利用组氨酸(His)与Cu(II)配位形成CHzyme，CHzyme具有将儿茶酚氧化为邻苯醌的活性，而生成产物邻苯醌可进一步与邻苯二胺(OPD)通过席夫碱化学反应生成荧光产物。将席夫碱化学引入到CHzyme的催化反应具有两个主要优点，即CHzyme催化活性的增强和输出信号的高度可编程性，这有利于提高分析的灵敏度和准确度。之后，全面研究了席夫碱化学偶联的CHzyme级联反应作为用于生物传感的底物传感模式(流程图)：(1)催化底物传感模式。CHzyme可将儿茶酚氧化成邻苯醌，邻苯醌可与OPD通过席夫碱化学反应生成荧光产物(λem = 590 nm)，有利于儿茶酚的“开启”荧光检测；(2)竞争底物传感模式。抗坏血酸可与儿茶酚竞争CHzyme催化的氧化反应，然后与OPD反应形成比率荧光检测，使新产生的发射峰(λem = 425 nm)增大，原有的发射峰(λem = 590 nm)减小；(3)生成底物传感模式。ALP可以水解AA2P生成抗坏血酸，通过竞争底物传感模式进行传感，从而检测ALP的活性。在上述探索的驱动下，通过使用ALP-IgG构建分析物和ALP-IgG之间的相对浓度关系，提出了检测CLL的比率荧光ELISA方法。

流程图:(A)CHzyme催化的邻苯二酚氧化反应与席夫碱化学的级联反应及邻苯二酚的催化底物传感模式；(B)用于生物传感的CHzyme常规类氧化酶反应；(C)抗坏血酸的竞争传感模式；(D)碱性磷酸酯酶活性的生成底物传感模式；(E)生成底物传感模式构建的FELISA与传统ELISA的对比。

图1. (A)CHzyme的SEM图像。(B)CHzyme的碳、氮、氧和铜元素的元素图谱。(C)CHzyme和His的XPS测量光谱。(D)CHzyme的Cu 2p光谱。E–G. CHzyme和His XPS光谱: (E) C 1s；(F) O 1s；(G) N 1s。(H)CHzyme和组氨酸的红外光谱。(D)CHzyme的XRD图。

图2. (A)席夫碱化学增强的类儿茶酚氧化酶CHzyme的荧光光谱，以及插图中(1)席夫碱化学增强的儿茶酚氧化酶样活性和(2)CHzyme的氧化酶样活性的比较。(B)反应溶液的pH值。(C)反应时间。(D)类儿茶酚氧化酶CHzyme的可能催化机制的图解。

图3.(A)基于底物传感模式的儿茶酚荧光检测。(B)儿茶酚检测结果的荧光光谱。(C)检测过儿茶酚方法的校准曲线。(D)检测儿茶酚方法的特异性。(E)基于竞争底物传感模式的抗坏血酸比率荧光检测。(F)抗坏血酸检测结果的荧光光谱。(G)检测抗坏血酸方法的校准曲线。(H)所提出的检测抗坏血酸方法的特异性。(I)基于生成的底物传感模式的ALP活性的比率荧光检测。(J)ALP活性检测结果的荧光光谱。(K) ALP活性检测分析性能的校准曲线，线性范围在插图中。(L)所提出的检测ALP活性的方法的特异性。

图4. (A)基于通用传感模式拟议比率FELISA的方案。(B)检测各种浓度CLL的比率FELISA的荧光光谱。(C)比率FELISA分析性能的校准曲线，线性范围在插图中。(D)比率FLISA的特异性，插图中有干扰物的化学结构。(E)传统ELISA分析性能的校准曲线。(F)在真实样品中比率FELISA的检测结果，回收率以虚线表示。

转自：“NANO学术”微信公众号

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