英文原题：Discovery of 2,6-Dihalopurines as Stomata Opening Inhibitors: Implication of an LRX-Mediated H+-ATPase Phosphorylation Pathway
通讯作者：Kazuhiro J. Fujimoto, Kazuma Amaike, Toshinori Kinoshita, Kenichiro Itami
供稿人：高瑞，北京大学
大家好，本期为大家分享一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，标题为“Discovery of 2,6-Dihalopurines as Stomata Opening Inhibitors: Implication of an LRX-Mediated H+-ATPase Phosphorylation Pathway”。文章的通讯作者是来自日本名古屋大学的Kazuhiro J. Fujimoto、Kazuma Amaike、Toshinori Kinoshita以及 Kenichiro Itami四位教授。
气孔（stomata）作为植物表皮所特有的结构，广泛存在于植物的叶、茎甚至花瓣等器官中。通常来讲，植物气孔是由两片保卫细胞（guard cells）结合形成，中间的孔状结构可以通过保卫细胞的形态调节实现开合，从而在植物的呼吸、蒸腾等过程中成为空气和水的进出通路，从而参与到植物的生长甚至对外界刺激的响应等生理过程中。
由于气孔在上述过程中的关键作用，通过人为的手段去对气孔的开合进行调控就成为实现不同农业目标的重要策略。在一些转基因植物（如水稻和拟南芥等）上进行的遗传学研究已经表明，通过基因改造的手段控制气孔开合对于农作物的培养是非常有帮助的。另一方面，在相对干燥 的环境中，通过一定程度地抑制气孔张开，也可以使得植物获得更强的抗旱能力。然而，传统的基因调控技术存在着局限性，即针对不同种类以及生长在不同环境下的植物，人们需要完全不同的基因改造方式来实现对目标植物气孔的有效调控。而近年来，小分子与调控植物策略日益兴起，成为对传统转基因策略的补足。小分子对植物调控的优点就在于不需要在植物培育前进行预先的基因改造，同时也对不同各类的植物具有相对的普适性。
事实上，在一些可以进行气孔调控的小分子（如脱落酸激动剂、壳梭孢素等）被人们陆续发现后，针对这些小分子的机制研究也同时为我们逐渐绘制出植物细胞内决定气孔开合运动的相关通路，例如植物细胞膜上的P型质子泵蛋白H+-ATPase就被证明是调控气孔开合的关键蛋白。作者的研究团队在先前的工作中也发现了一系列可以阻断气孔张开的小分子SCL1-9。而在本篇工作中，他们又基于先前所发展的可以影响植物生长的小分子库进行筛选，发现其中一种基于嘌呤结构的化合物AU1展现出抑制气孔打开的作用。在初步的结构-功能关系研究中，他们将AU1分子的结构进行了优化，获得了2,6-二氯嘌呤衍生物分子AU2。在功能上，AU2展现出了与AU1类似甚至更好的气孔抑制效果，且分子本身比AU1更加方便进行有机合成。
图1. 气孔抑制剂小分子。a) 先前所报道的非脱落酸类气孔抑制剂小分子SCL；b) 对AU1分子进行结构优化后获得了抑制效果更明显的AU2分子。
随后，为了从结构上系统地探究AU2分子上各个取代基与位置在对气孔的抑制方面的作用，作者团队对AU2上的C2、C6以及N9等位置进行了不同基团的取代反应改造，获得了一系列基于AU2分子的衍生物分子。为了对所获得的小分子进行功能与结构的评估，他们将这些分子进行了基于AI成像定量实验的筛选。即将模型植物圆叶鸭拓草的叶子切片样品加入小分子后进行黑暗-光照处理，随后在显微镜下进行气孔的成像，并通过软件进行气孔面积的计算与比较。结果显示C2位的卤素以及C6位的氯原子取代基对于AU类分子对气孔抑制的活性是非常重要的，而N9位上取代的苯基间位以及连接的碳链长度都可以进行多种修饰改造。
图2. AU类分子衍生物的获得以及活性评估。a,b,c) 对AU分子上各位置的取代与改造，从而获得多种不同的衍生物。d,f) 基于成像的气孔开合评估流程以及对AU分子各位置取代基的分析结果。
在系统地研究了AU类分子本身各官能团与取代基的作用后，作者团队对这些分子在植物气孔调控通路中的作用机制进行了探究。在蓝光的照射下，保卫细胞表面的光受体蛋白被激活，从而通过一系列下游激酶的磷酸化进行信号传导，随后使得细胞膜表面的质子泵蛋白H+-ATPase的C端产生磷酸化修饰，从而与伴侣蛋白14-3-3产生相互作用，使得细胞内产生了负电势。为了抵消这一胞内电势，细胞膜表面的离子通道泵入钾离子并随后使得水分子内流。保卫细胞体积胀大后，由于相向的内壁厚、外壁薄，两片保卫细胞拱起使得气孔张开。在使用壳梭孢素介导H+-ATPase的C端产生磷酸化修饰后，AU分子并不能抑制气孔的关闭，这说明AU类分子并不能影响下游的通路。而当不再使用壳梭孢素持续磷酸化H+-ATPase的C端后，作者使用H+-ATPase的磷酸化抗体对AU处理后的细胞进行免疫印迹检测，结果发现AU处理下的磷酸化信号明显降低，这说明AU分子是通过上游的某种作用抑制了H+-ATPase的C端磷酸化，从而阻断了下游的信号抑制气孔张开。
图3. 对AU分子参与的气孔调控通路的探究，结果证明AU分子通过阻断H+-ATPase的C端磷酸化来抑制植物气孔的张开。
随后作者设计了亲和富集实验对AU分子的相互作用蛋白进行了探究。在对AU2分子进行改造后，他们合成了带有点击化学反应基团的AU4分子并证明其同样拥有对气孔的抑制效果。接着他们将这一分子探针加入到植物细胞裂解液中进行亲和富集与质谱鉴定，结果显示一类富含亮氨酸重复的伸展蛋白（Leucine-rich repeat extensin protein, LRX）在每一次的重复实验中都被鉴定到。在分子动态模拟中，他们发现AU分子可以和LRX2-RALF4蛋白复合物产生的口袋形成快速稳定的结合。这一结果表明AU分子可以通过与LRX-RALF复合物进行结合，从而在上游抑制H+-ATPase的C端产生磷酸化进而抑制植物气孔的张开。
图4. 对AU分子进行改造后获得的亲和富集探针用于AU相互作用蛋白鉴定。多次重复实验所鉴定到的LRX蛋白在结构分析上通过与RALF蛋白形成口袋结构并稳定结合AU分子。
总而言之，在本篇工作中，作者发现了一类可以抑制植物气孔张开的小分子，并系统地对分子本身的取代基官能团、参与的信号调节通路以及相互作用蛋白鉴定等方面对这一类分子抑制气孔张开的机制进行了详细的研究。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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