NCB | 新型CRISPR/Cas9变体！Sniper2L可同时兼具高保真性和高活性

由于脱靶效应或在靶标位点的编辑效率较低，Spcas9诱导的基因组编辑的应用经常受到限制。一些高保真的变体，如eSpCas9, Cas9-HF1, HypaCas9, Cas9_R63A/Q768A, evoCas9, HiFi Cas9和Sniper-Cas9也已经被开发出来。然而，在进行大规模的靶标测试时发现，这些变体在减少脱靶的同时，也导致了靶标位点编辑效率的降低。因此，开发一种具有与SpCas9相似活性水平的高保真变体，将促进基于SpCas9的基因组编辑在基因治疗和遗传筛查等领域的应用。

近日，《Nature Chemical Biology》在线发表了题为“Sniper2L is a high-fidelity Cas9 variant with high activity”的研究论文，作者在先前开发的Sniper1变体的基础上再次进行定向进化，开发了一种同时兼具高保真性、高活性的SpCas9变体Sniper2L。为了评估Sniper2L在大量靶序列上的特异性和活性，作者还使用两种不同的方法将其与sgRNA一起递送：慢病毒表达和核糖核蛋白(RNP)复合物电穿孔。通过高通量评估表明，发现Sniper2L表现出比Sniper1更高的保真度，同时保持其一般的活性水平，与SpCas9相似，克服了活性和特异性之间的权衡。

作者首先以具有随机突变的Sniper1蛋白建立筛选库，使用EMX1.6 sgRNA重复4次Sniper-screen选择过程。对最终克隆进行测序，发现Sniper1第1007位氨基酸是一个重要位点。作者在第1007个氨基酸位点引入所有可能的氨基酸突变，并使用另外3个sgRNA检测这19个变体在错配和不错配靶标序列上的活性，最终发现具有E1007L和E1007P的变体表现出高靶活性和低脱靶效应(图1)。将E1007L和E1007P变体分别命名为Sniper2L和Sniper2P，用于后续研究。

为了评估这两种变体在大量的靶序列上的活性，作者采用了一种高通量评估方法。首先使用库A确定Sniper2变体的PAM兼容性，其中包含具有NNNN PAMs的目标序列。我们发现与Sniper1变体的PAM兼容性是相同的，并且在NGG PAMs的目标序列中观察到最高的平均活性。这些结果与其他高保真变体的PAM兼容性一致。作者随后使用了B库中含有NGG PAMs的8744个靶序列，发现Sniper2L表现出明显高于Sniper1的效率，而Sniper2P诱导的indel频率最低。基于编辑效率以及错配效应，最终选择Sniper2L作为新版本的Sniper1（图2）。

Sniper2L表现出更高的特异性和高活性

我们之前观察到SpCas9变体的活性和特异性之间存在权衡。当其表现出高保真度或特异性时，它也表现出相对较低的编辑活性。为了检验Sniper2变体是否遵循这一趋势，作者使用8种sgRNA检测了它们的活性和特异性。我们观察到，与Sniper1相比，Sniper2L显示出更高的保真度和更高的靶标编辑。据我们所知，Sniper2L是第一个也是唯一一个在不牺牲其一般活性水平的情况下获得特异性的变体（图2g）。

作为RNPs交付的SpCas9变体评估

在对人类患者进行体外基因组编辑治疗期间，SpCas9和sgRNA经常以预先组装的RNP形式递送。考虑到递送方式会影响SpCas9的on- and -off活性，作者进一步比较了SpCas9、Sniper1和Sniper2L作为RNPs传递时的活性。在6个不同的目标序列上进行单独测试时，发现Sniper2L整体上比SpCas9表现出更高的靶上活性和更低的脱靶活性(图3a)，这表明以RNP形式递送的Sniper2L具有潜在的优势。作者接下来评估了A库30个完全匹配的靶序列的核酸酶活性，发现除Cas9_R63A/Q768A活性相对较低外，其他高保真变体的活性基本相似 (图3b)。作者还测试了错配靶标序列的indel频率，发现与其他变体相比，Sniper2L在不匹配目标上高度不活跃(图3c)。综上所述，与之前报道的高保真变体相比，Sniper2L在以慢病毒或RNP形式递送时表现出较高的靶标编辑活性和相对较低的脱靶活性。

最后，作者使用单分子方法检测了SpCas9变体的保真度，发现Sniper2L是其中特异性最强的（图4）。鉴于Sniper2L在匹配和不匹配目标序列上的活动依赖于目标序列，准确预测Sniper2L的活动将有利于Sniper2L的使用。因此，作者开发了基于深度学习的计算模型，通过(G/ G)N19和tRNA-N20 sgRNAs在匹配的目标序列(图5a)和(G/ G)N19 sgRNAs在不匹配的目标序列预测Sniper2L和Sniper1的活性，并将这些计算模型统称为DeepSniper，网站链接：

http://deepcrispr.info/DeepSniper。

综上，作者通过随机诱变后的多轮筛选发现了Sniper2L，一种新的高保真，高活性的SpCas9变体，其编辑效率与SpCas9相当。Sniper2L将在要求高效率和低脱靶效应的基因组编辑中具有广泛的应用潜力。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41589-023-01279-5

Sniper1变体可参考文章“Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its Specificity”。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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