以下文章来源于Mol Plant植物科学 ，作者SCI Shi
2023年3月6日，Nature Plants在线发表了美国加州大学洛杉矶分校Steven E. Jacobsen团队及其合作者题为“A gene silencing screen uncovers diverse tools for targeted gene repression in Arabidopsis”的研究论文。该研究通过对人工锌指融合蛋白诱导目标基因沉默的功能筛选，发现了许多通过DNA甲基化、组蛋白H3K27me3沉积、H3K4me3去甲基化、组蛋白去乙酰化、抑制RNA聚合酶II 转录延伸或去磷酸化来抑制基因表达的蛋白质；为靶基因沉默提供了新的工具。
https://doi.org/10.1038/s41477-023-01362-8
基因的转录调控是一个基本的生物学过程，可通过DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，来控制基因表达的开启或关闭。在植物中，DNA甲基化通常与转录水平的基因沉默有关。此外，组蛋白修饰或去除激活的组蛋白标记也可介导基因沉默，如多梳抑制复合体PRC1和PRC2。
人工锌指结构（ZF）是一类人工设计的DNA结合域，可结合特定序列并将融合蛋白引导至特定位点。当ZF与RNA指导的DNA甲基化（RdDM）组分SUVH9融合并转化含fwa表观等位基因的植物时，可回复FWA DNA甲基化和基因抑制。然而，其他沉默途径是否也可用于操纵基因的表达，尚不清楚。
FWA转录因子的过表达会导致晚开花，同时产生更多的叶子；利用FWA作为报告基因，研究人员对270个拟南芥染色质蛋白与ZF融合，并筛选能够沉默FWA的融合蛋白。结果显示，14种效应蛋白能够沉默FWA，并诱导植物的早开花。这些蛋白包括参与RdDM途径的DMS3、SUVH2、SUVH9和MORC1；以及MSI1、LHP1、JMJ14和JMJ18、HD2A、HD2B、HD2C和HDA6、PAF1、ELF7和CPL2等（Figure 1）。
Figure 1. 可介导ZF靶基因沉默的效应蛋白
利用亚硫酸盐靶基因扩增高通量测序（BS-PCR-seq），该研究证实ZF-SUVH2融合蛋白介导的DNA甲基化可遗传到T2代，并诱导植物的早开花。由于融合蛋白表达水平的差异，具有高水平转基因表达的植物倾向于早开花，而具有低蛋白表达水平的植物倾向于晚开花。MSI1是PRC2复合体的组成因子，可与PRC2辅助蛋白LHP1相互作用；该研究发现，MSI1和LHP1与FWA靶基因的结合可诱导H3K27me3沉积相关的基因沉默。同时，JMJ14可能通过去除H3K4me3，而不是通过促进H3K27me3（一种与H3K4me3对抗的标记）的积累，来诱导基因沉默（Figure 2）。
Figure 2. H3K27me3沉积和H3K4me3去甲基化介导的靶基因沉默
HD2A可通过H3K9去乙酰化诱导核糖体RNA的基因沉默，而HD2C则可诱导H4K16的去乙酰化；另外，HDA6可使多种底物去乙酰化，包括H3组蛋白尾部的K9、K14、K18、K23和K27，以及H4组蛋白尾部的K5、K8和K12。该研究发现，HDA6和MSI1-ZF至少部分通过组蛋白H3K9和H3K14去乙酰化，来抑制靶基因的表达；表明可以利用不同类别的各种HDAC蛋白进行靶基因的沉默（Figure 3）。
Figure 3. HDAC和组蛋白去乙酰化诱导的靶基因沉默
由于Pol II可与ELF7-ZF相互作用，被束缚在ZF的结合位点上，从而抑制Pol II介导的基因转录，并导致基因沉默。PAF1C是Pol II转录延伸所必需的；PAF1C和ELF7在启动子上形成复合物是一种新的诱导基因沉默的机制，这种机制可独立于特定表观遗传标记的变化。此外，CPL2-ZF可通过Pol II CTD Ser5的去磷酸化沉默靶基因，尽管其确切机制仍然未知；表明CPL2介导的启动子束缚代表了靶基因沉默的新机制（Figure 4）。
Figure 4. 通过 ELF7、CPL2和Pol II转录中断进行靶基因沉默
最后，该研究将代表针对基因沉默的不同表观遗传途径的SUVH2、JMJ14、LHP1、HD2C、ELF7和CPL2分别克隆到基于dCas9的SunTag系统中；这些单个dCas9可以募集多个效应蛋白。在fwa rdr6双突变体中，研究人员观察到JMJ14和LHP1诱导的FWA基因沉默和早开花表型， ELF7和HD2C的表现较弱，而SUVH2、CPL2或对照则没有表型。这些结果表明，该研究中鉴定出的某些效应蛋白也可通过SunTag系统进行靶基因沉默（Figure 5）。
Figure 5. 通过SunTag系统进行靶基因沉默
综上所述，该研究筛选到14种可介导靶基因沉默的效应蛋白，它们可通过不同的机制来沉默FWA的表达，包括建立DNA甲基化、H3K27me3沉积、H3K4me3去甲基化、H3K9、H3K14、H3K27和H4K16去乙酰化、抑制Pol II的转录延伸或去磷酸化。此外，一些效应蛋白还能够使用基于CRISPR/dCas9的SunTag系统来诱导靶基因沉默；这些发现为更详细地了解基因沉默途径的机制奠定了基础，并为靶基因沉默提供了一系列的新工具。
转自：“iPlants”微信公众号
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