美国研究人员揭示植物GalS1合成RGI半乳聚糖侧链的结构和生化特征

2023年2月27日，Nature Plants在线发表了美国佐治亚大学、橡树岭国家实验室Breeanna R. Urbanowicz团队及其合作者题为“Structural and biochemical insight into a modular β-1,4-galactan synthase in plants”的研究论文。该研究通过表达并纯化GalS1的GFP融合蛋白，分别解析了GalS1的apo形式及其与Mn2+结合的两种结构形式；分析显示，GalS1在体外以二聚体形式存在，其CBM、茎干结构域和GT-A结构域在半乳聚糖链延长的过程中至关重要；为GalS1合成半乳聚糖侧链的提供了新的见解。

https://doi.org/10.1038/s41477-023-01358-4

植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶、蛋白质和多酚化合物组成的复杂细胞外基质；然而，目前对构成植物细胞壁的碳水化合物的合成和基本生物学，仍知之甚少。鼠李聚糖半乳糖醛酸I（RGI）是一种结构复杂的果胶多糖，具有交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链，以及阿拉伯聚糖（arabinan）和半乳聚糖（galactan）侧链。它们是通过多种碳水化合物活性酶，特别是糖基转移酶（GT）的协同作用合成的。半乳聚糖合酶（GalSs）属于GT92家族；可参与RGI的β-1,4-连接的半乳聚糖侧链的合成（Figure 1）。

Figure 1. GalS1在RGI生物合成中的作用

通过在HEK293S GnT1细胞中表达并纯化GalS1的GFP融合蛋白，该研究首先解析了GalS1的两个结构：2.37Å分辨率水平上的apo形式和2.56Å分辨率水平上与Mn2+的结合形式。利用多角度光散射器尺寸筛析色谱法（SEC-MALS），该研究发现GalS1在体外可形成二聚体；它们具有两个可能界面，在溶液中以平行（A:B）或反平行（A:C）排列（Figure 2）。

Figure 2. GalS1的结构特征

结构分析显示，GalS1具有家族95的碳水化合物结合模块（CBM95）；利用突变体，研究人员发现，CBM95和茎干结构域对于维持GalS1的稳定性和活性至关重要。此外，GalS1具有GT92家族保守的GT-A折叠结构域。对该结构域中的保守氨基酸进行突变及其对酶-底物供体相互作用的影响，该研究发现E334、Q309和H414可直接与GalS1中的 UDP-Gal/UDP-Arap相互作用，并且是糖基转移酶活性所必需的（Figure 3）。

Figure 3. GalS1中GT92家族保守氨基酸的功能分析

通过对接（docking）和分子动力学模拟，研究人员显示UDP-Gal-Mn2+-GalS1复合物中底物供体在整个100 ns过程中保持结合；表明供体分子在活性位点上存在假定的结合姿势。尽管这种姿势本身并不代表它就是具有催化能力的构型，但这种在分子动力学模拟中能够在10 ns内稳定的三元复合物，提供了一种有利构型，并可能介导了反应的催化机制（Figure 4）。

Figure 4. GalS1的对接和分子动力学模拟

综上所述，该研究通过表达纯化GalS1的GFP融合蛋白，成功解析了GalS1在2.37Å分辨率水平上的apo形式和2.56Å分辨率水平上与Mn2+的结合形式；并提出了GalS1合成半乳聚糖侧链的反应机制：GalS1的催化碱基（His414）使受体的亲核羟基去质子化，进而攻击UDP-α-d-Gal供体的亲核异头碳（anomeric carbon）并取代磷酸盐离去基团（Figure 5a）；GalS1以二聚体形式与RGI结合，茎干结构域以“握手”方向在链间相互作用；CBM和核心GT-A结构域在半乳聚糖链延长的过程中发挥重要作用（Figure 5b）。

Figure 5. GalS1合成半乳聚糖的推测机制

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-023-01358-4

来源：MP植物科学

转自：“iPlants”微信公众号

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