Advanced Science | 福建医科大学刘小龙/张达构建基于丝凝胶的CRISPR/Cas9基因工程腺病毒递送系统

免疫检查点阻断疗法在患者临床应用中成果显著，但失效快使其治疗应用受到进一步限制。

2023年2月25日，福建医科大学刘小龙及张达共同通讯在Advanced Science 在线发表题为“Silk-Gel Powered Adenoviral Vector Enables Robust Genome Editing of PD-L1 to Augment Immunotherapy across Multiple Tumor Models”的研究论文，该研究开发了一种递送CRISPR/Cas9的基因工程腺病毒（sgCas9-AdV），以实现永久性PD-L1基因编辑，在Hepa 1-6肝癌细胞中效率高达78.7%。此外，sgCas9-AdV被装载到由丝纤维制成的水凝胶中（SgCas9-AdV/凝胶），以实现体内应用。丝凝胶不仅促进sgCas9-AdV在肿瘤组织中的局部滞留，还能屏蔽宿主免疫系统，确保9天内均能进行有效地基因转导。

sgCas9-AdV/Gel 通过破坏PD-L1引发T细胞介导的抗肿瘤反应抑制 Hepa 1-6肿瘤生长，单剂量注射的反应率为100%。此外，sgCas9-AdV/Gel也能应用于其他难治性肿瘤。应用抗PD-L1反应治疗CT26结肠癌效果较差，实验证明sgCas9-AdV/Gel策略能够产生足够的抗PD-L1抗体来抑制肿瘤进展。在高侵袭性的原位4T1小鼠乳腺肿瘤中，该方法显著抑制原发性肿瘤生长，并诱导了针对肿瘤复发/转移的持久免疫应答。因此，该研究为免疫治疗提供了一种潜在的通用策略。

免疫检查点阻断（ICB）治疗作为最具代表性的免疫治疗方式，在肿瘤治疗领域取得了突破性进展。靶向程序性死亡-1（PD-1）和程序性死亡配体1（PD-L1）的单克隆抗体在癌症治疗中临床效果显著，受到相关学者的广泛关注。然而，PD-1//PD-L1对实体瘤的治疗效果有限（10-35%），治疗细胞极易产生耐药性。研究表明，当肿瘤细胞表面的PD-L1被PD-L1抗体阻断时，肿瘤细胞会巧妙地将细胞内PD-L1重新组装到细胞表面，以维持稳态，最终产生免疫抵抗。因此，寻找有效的替代品来完全和永久沉默癌细胞的PD-L1表达是增强ICB疗效的潜在策略。

CRISPR/Cas9作为永久且精确编辑基因组的有力工具前景广阔，为解决ICB阻断遇到的常见问题提供了可靠策略。CRISPR/Cas9由单向导RNA（sgRNA）和Cas9核酸内切酶简化形成sgRNA/Cas9复合物，在基因组中产生位点特异性双链断裂（DSB）。因此，非同源末端连接的断裂修复促使基因敲除。由于sgRNA和Cas9核酸内切酶并非天然存在于哺乳动物中，且膜渗透性差，因此安全有效地递送CRISPR / Cas9组分对于推进其体内进行基因组编辑意义重大。

尽管非病毒载体简单且安全，但仍受到转导效率差和基因组编辑效果不佳的影响。相比之下，病毒载体是迄今为止递送各种核酸药物（包括CRISPR / Cas9系统）的最有效载体，其中一些已被批准用于临床。如腺相关病毒（AAV）递送的CRISPR最近已被批准用于消除CEP290基因上的突变，用于治疗视网膜变性（NCT03872479）。与AAV负载量受限（4.7 kb）相比，腺病毒（AdV）具有35 kb的负载容量，可装载在化脓性链球菌中发现的spCas9（Cas9的最广泛使用的形式），其序列大小超过4.2 kb。同时，AdVs几乎不会将外源基因整合到宿主基因组中，从而避免了致癌性或遗传毒性风险，加上临床试验中记录的最小副作用症状，AdVs可作为递送spCas9的合适载体。此外，迄今为止尚未进行过体内PD-L1基因编辑以放大ICB功效的探索。

构建用于PD-L1基因编辑的sgCas9-AdV和sgCas1-AdV/Gel的示意图（摘自Advanced Science）

尽管存在上述优势，但病毒载体递送基因存在的非特异性整合、抗病毒免疫和先天免疫反应等问题，为开发用于体内应用的病毒载体带来挑战。为规避上述障碍，大多数使用AdV作为基因递送载体的临床试验都采用了局部给药。在这种情况下，药物释放深受局部微环境的影响，如间质压力、组织间隙和细胞之间的空间。研究表明，病毒载体在肿瘤内给药后立即出现在其他远端部位（肝脏和血清），这与肿瘤微血管存在孔隙和渗漏导致的严重扩散问题相关。为减少病毒载体的系统传播，相当大的关注度集中在生物材料作为多功能平台实现病毒载体的有效和持续释放方面。其中，水凝胶具有适应流变特性、制造简单的优点，可与周围组织紧密接触而不干扰病毒载体的活性。

作为一种生物相容性材料，丝凝胶能够持续释放药物且免疫原性和细胞毒性较低，被用于局部注射以增强治疗效果。该研究报道了一种局部CRISPR/Cas9递送系统(sgCas9-AdV/Gel)，能够将负载编码spCas9和PD-L1靶向sgRNA的AdV载体加载到可注射的丝凝胶中。丝凝胶可保护sgCas9-AdV免受宿主抗体中和，确保sgCas9-AdV的持续释放以提高基因编辑效率和治疗效果。该研究从AdV释放、转导和PD-L9基因编辑效率方面表对sgCas9-AdV/Gel进行表征，并进一步应用该系统评估多个肿瘤模型的治疗效果，结果表明其能够增加抗肿瘤免疫反应且降低抗病毒免疫反应。

参考消息：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202206399

转自：“iNature”微信公众号

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