涨知识，随着科技手段的发展，检测手段也趋于多元化，2023年2月16日《Molecular Cancer》在线发表了《Recent advances of small extracellular vesicle biomarkers in breast cancer diagnosis and prognosis》总结了新的检测方法，用于乳腺癌的诊断和预后监测。
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目前用于乳腺癌（BC）诊断的临床工具不足，但不同体液的液体活检最近已成为一种微创策略，提供肿瘤生物标志物的实时数据，用于早期诊断，积极监测进展和治疗后复发。细胞外囊泡（EVs）是直径为50-1000nm的纳米尺寸膜状结构，由细胞释放到生物液体中。EVs含有蛋白质、核酸和脂质，它们通过细胞间的交流在肿瘤发生和转移中起着关键作用。使用基于质谱的蛋白质组学和下一代测序，正在研究来自50-150nm大小的小型Ev（sEV）的蛋白质和miRNZ作为新型BC生物标志物的潜在来源。
目前，用于检测、分期和预后癌症的最常见方式是组织活检。然而，组织活组织检查很难获得，并且来自活组织检查的肿瘤分子和遗传信息为早期检测，筛查和监测提供了有限的信息。乳房钼靶是唯一经过临床验证的BC早期诊断的成像方法，具有高假阴性诊断率和致密乳房组织的低灵敏度的缺陷。小的病变经常被遗漏，且可能通过乳房钼靶照片不可见。因此，在接受定期筛查的妇女中，很大一部分检测到的肿瘤已经扩散，因此这些患者在诊断时存在侵袭性淋巴结或一般转移。此外，一至两年的定期乳房x光检查并不能检测到高增长率的肿瘤。虽然由于筛查计划和术后辅助全身疗法（即激素治疗和化疗），患者的生存率在过去几十年中有所增加，但许多患者死于转移性复发。
癌症抗原15-3（CA15-3）的血清水平是目前用于BC监测的生物标志物。然而，CA15-3测量对诊断没有帮助，特别是在早期癌症患者中，并且对BC患者的治疗决策没有帮助。传统的预后标志物（诊断时的年龄，肿瘤大小，激素受体状态，肿瘤等级）不足以精确区分BC中的风险组。因此，对于发现准确且微创的生物标志物存在未满足的需求，用于BC患者的早期检测、预后、预测、治疗反应的监测和耐药性的预期。
为了克服传统上用于鉴定和验证临床生物标志物的技术的挑战，已经提出了基于液体活检的分析，其重点是循环肿瘤细胞（CTCs），循环肿瘤DNA（ctDNA），tumour-educated血小板和体液（包括血液，尿液和唾液）中的细胞外囊泡（EVs）。液体活组织检查比收集组织活组织检查提供了几个优点：侵入性较小;可以实时追踪癌症的异质性，转移和进展; 并且可以不断监测患者对治疗的反应。疼痛和副作用明显低于收集组织活检。
根据International Society of Extracellular Vesicles (ISEV)（ISEV）的说法，术语"细胞外囊泡"是从细胞培养上清液或生理液体中分离的囊泡异质群体的描述。EV群体由其大小和生物发生来定义：外泌体是由质膜和多囊体融合产生的小尺寸EVs（50-150nm）;大尺寸微血管（大EVs）（100-1000nm）直接由质膜形成; 和凋亡体（500-5000nm）是程序性细胞死亡期间产生的最大Ev。但是，有不同的分类系统，这些组不一定是相互排斥的。例如，在ISEV2018指南中，EV亚型按EV尺寸（小Ev<200nm，大Ev>200nm），密度和生化成分（例如CD63，CD81，Annexin A5）等物理特征进行分类。大型EVs（lEVs）的密度为1.10-1.15g/mL，Cav–1，CK18和GAPDH表达，而小型EVs（sEVs）的特征是CD9，CD63，CD81，TSG101，Alix，Flotilin-1和热休克蛋白（HSPs），密度范围为1.05-1.2g/mL。
EVs存在于所有生物流体中，包括血液，尿液，母乳，唾液，腹水和脑脊液。在多细胞生物中，sEVs在通过各种RNA，蛋白质和脂质从细胞到细胞以及肿瘤微环境内传递生物信息方面发挥着重要作用。几项研究报道，癌细胞释放出比正常细胞更多的sEVs，它们的biological cargoes反映了起源细胞，因此作为疾病诊断，预后和监测的优越生物标志物候选者。此外，基因组和蛋白质组分析研究表明，BC患者和健康对照之间的sEV含量和数量不同，这表明它们可能是肿瘤信息的独特来源。
在这篇综述中，总结了为sEV分离和单sEV分析开发的新技术。sEV包含多种类型的生物分子，但这里的重点将是蛋白质和miRNA生物标志物的BC诊断和预后。基于sEV的生物标志物研究的局限性将与sEV作为新型临床生物标志物来源的未来前景一起讨论。
图1.液体活检用于乳腺癌（BC）诊断。
从BC患者收集体液用于液体活检分析。 循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和细胞外囊泡可通过液体活检检测。这种方法在BC诊断中有几个优点，例如能够追踪异质性，实时监测肿瘤转移和进展，减少疼痛和副作用，并且与组织活检相比，获得样本的过程更快，更容易。在通过液体活组织检查检测的分析物中，细胞外囊泡具有优越的特征，例如，在各种体液中的丰度，具有包封的生物活性分子的稳定形式，以及其起源细胞
表1乳腺癌研究中小细胞外囊泡分析方法总结
图2. 小细胞外囊泡(sEV)检测和表征.
从乳腺癌（BC）血液样本和细胞系中分离的sEV可以通过大小，形态，浓度和sEV标记物来表征。可以通过纳米粒子跟踪分析（NTA）和单粒子干涉反射率成像传感器（SP-IRIS）分析尺寸分布和浓度。各种类型的电子显微镜（EM）可以帮助根据尺寸和形态对sEV进行分类。纳米流式细胞术（nFCM），高灵敏度流式细胞术（HSFCM），高分辨率流式细胞术（hFCM）和荧光激活囊泡分选（FAVS）可以使用各种sEV标记物对分离样品中的sEV亚群进行分选。sEV蛋白可以通过基于质谱的分析法进行分析，包括无标签和基于标签的定量。为了验证sEV蛋白和肽标记物，可以使用多重反应监测（MRM），平行反应监测（PRM），western印迹（WB）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。
图3.小细胞外囊泡（sv）蛋白生物标志物，包括翻译后修饰（PTMs），在乳腺癌（BC）诊断，预后和化疗耐药。
从BC患者的细胞上清液和血液样品中收集sEVs。分离的sEV通过蛋白质组学策略进行分析，如液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）和反相蛋白微阵列（RPPA），并通过sEV蛋白检测方法（包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和western印迹（ 鉴定了BC sEV样品中各种上调或下调的蛋白质，可用于BC诊断，预后和BC化学抗性的预测。
表2小细胞外囊泡蛋白生物标志物，包括翻译后修饰，在乳腺癌诊断，预后，化疗耐药的作用
图4.小细胞外囊泡（sEV）miRNA生物标志物在乳腺癌（BC）的诊断，预后，化疗耐药。
收集BC血浆和细胞上清液样品，并通过逆转录酶-定量聚合酶链反应（RT-qPCR），下一代测序（NGS）和微阵列分析分析分离的含有mirna的sEVs。BC样品独特的sEV miRNA表达谱对于BC的诊断，预后和预测化疗耐药具有价值。
表3小细胞外囊泡miRNA生物标志物在乳腺癌诊断、预后和化疗耐药中的应用
为了改善BC诊断和预后，研究人员越来越多地关注液体活检，因为其有限的侵袭性和适用于癌症监测。根据这里描述的证据，监测sEV衍生的蛋白质和miRNA的变化对于BC生物标志物翻译具有巨大的潜力和前景。
首先，可能需要多种方法的组合来准确诊断或预测BC。最近的几行研究集中在BC多omic生物标志物标志，其对诊断和预后的敏感性高于单组学生物标志物。例如，血清sEV分化拮抗非蛋白编码RNA（DANCR）与传统肿瘤标志物CA15-3和CEA的组合在BC诊断值中显示出91.4％的特异性和90.8％的敏感性，与个体生物标志物相比 此外，血清sEV miR-1910-3p与CA15-3的组合比BC中具有96％诊断敏感性的个体生物标志物更敏感。对于早期BC患者，尿sEV miR-21和基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的联合表达显示出改善的敏感性（95％）和特异性（79％）。需要额外的研究来评估多单组学生物标志物。
其次，细胞外囊泡和颗粒（EVPs）是异源纳米囊泡和颗粒，根据大小分类为亚群。在2018中，人们发现一个名为exomeres（小于35nm）的新EVP亚群与其他EV亚群相比具有明显的N-聚糖和蛋白质组学分析，并且exomeres蛋白质与糖酵解，代谢途径，凝血和缺氧 2021年，报道了名为supermeres的最小Evp，这些supermeres显示出相对于外泌体和sEVs的不同RNA和蛋白质谱。几种肿瘤相关蛋白和EV相关Rna在超微球中富集。因此，蛋白质、聚糖、脂质和核酸可能被选择性地封装到不同的EVP亚群中，并且在肿瘤生物学方面具有独特的生物力学特征和功能。需要更多的工作来彻底表征每个EVP亚群，并且需要开发更好的EVP隔离技术，以成本和时间效率的方式获得高质量的样品。
已经取得了进展，但将sEV生物标志物从研发带到临床还有很长的路要走。缺乏分离和表征的标准化阻碍了进展，导致重复性降低和显着的研究间变异。此外，有限数量的研究队列，异质临床样本和生物流体的复杂性是临床环境中生物标志物效用的额外障碍。尽管存在这些挑战，sEV蛋白和mirna是BC的有希望的候选生物标志物，临床用途的研究和开发正在向前发展。
内容来源：https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-023-01741-x
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