导读
中药何首乌是何首乌植物的干燥块根，其已在临床上用于多种药理活性。然而，近年来许多研究者们报道了何首乌致肝损伤（PMR-ILI）的情况，这在一定程度上限制了何首乌的临床应用。总的来说，PMR-ILI的发生并不普遍，因此，找出PMR-ILI与何首乌根耐受组（PMR-T）之间的差异代谢特征，对于PMR-ILI的合理临床应用和早期临床诊断具有重要意义。在本研究中，我们收集了6份PMR-ILI和13份PMR-T临床血浆样品，并通过高分辨率液相色谱-质谱法（LC-MS）进行分析。首先，我们通过常规筛选方法（如多元统计分析）选择两组的差异代谢产物。其次，我们通过与临床肝损伤指标的相关性分析、随机森林分析和受试者工作特征曲线（ROC），筛选出具有更大贡献度、与肝损伤相关和高灵敏性的特征代谢产物。经多变量统计分析和筛选分析，我们共鉴定出29种差异代谢产物。与PMR-T组相比，PMR-ILI组的甘油和磷脂代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、鞘脂和色氨酸代谢出现紊乱。通过与肝损伤指数进行相关性分析和随机森林筛选，我们获得了8个与临床肝损伤密切相关的潜在生物标志物。最后，通过ROC分析，我们筛选出PMR-ILI中高表达的3种潜在生物标志物，分别为次黄嘌呤、LysoPC（P-16:0/0:0）和牛磺脱氧胆酸，可为早期临床诊断提供依据。基于LC-MS对PMR-ILI和PMR-T血浆样品的分析，我们最后选择了何首乌临床肝损伤的三种生物标志物：即次黄嘌呤、LysoPC（P-16:0/0:0）和牛磺脱氧胆酸。
亮点：
1. 本研究分析临床PMR-T和PMR-ILI样本，以探究PMR-ILII的生物标志物；
2. 本研究利用相关分析和随机森林法筛选PMR-ILI的生物标志物；
3. 本研究筛选出与PMR-ILI相关的具有高灵敏度的经典生物标志物。
论文ID
原名：Potential biomarkers screening of Polygonum multiflorum radix-induced liver injury based on metabonomics analysis of clinical samples
译名：基于临床样本代谢组学分析筛选何首乌致肝损伤的潜在生物标志物
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2023.02
通讯作者：孙震晓，于浩
通讯作者单位：北京中医药大学生命科学学院，首都医科大学附属北京地坛医院
期刊介绍
实验结果
1. 临床病例的一般情况
从病人入院到样本采集，我们定期监测所有病例的血液生化指标，用于血浆样本检测病例的同一天血液和生化肝功能指标数据列于表1。
表1 临床病例概况资料
*表中的剂量栏表示患者每天服用的药物中所含PMR的质量。
表中的类型（type）列表示患者接受的PMR类型，其中R表示未炮制的PMR（生药），P表示炮制的PMR。
2. 液相色谱质谱（LC-MS）检测临床血浆样品
我们用Thermo Q Exactive Plus Orbitrap MS扫描血浆样品，获得正离子模式和负离子模式下的总离子色谱图（TIC），结果如图1所示。
图1 临床血浆样品总离子色谱图（A：正离子模式；B：负离子模式）。
我们将LC-MS的原始数据导入Compound Discovery 3.0软件以获得包括保留时间（RT）、m/z值和响应值的数据集。数据归一化后，我们将其导入Simca-P软件进行多元统计分析。如图2A所示，我们在主成分分析（PCA）图上可以清楚地区分PMR-ILI组和PMR-T组，这表明PMR-ILII组和PMR-T组的代谢谱之间存在明显差异。当使用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）模型分析数据时，两组之间的差异程度非常显著（图2B）。我们对PLS-DA模型进行了置换检验（图2C）。拟合直线的斜率为正，Q2在Y轴上的截距小于0.05，表明PLS-DA模型没有过拟合。结果表明，LC-MS检测到的PMR肝损伤组和PMR耐受组之间的血浆代谢物存在明显差异。
图2 PMR耐受组和PMR肝损伤组的多变量统计分析（A：PCA；B：PLS-DA；C：置换检验，D：S图）。
3. 差异代谢物的筛选与鉴定
我们根据正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型中的S图结果，并结合p小于0.05和变量投影重要性（VIP）大于1，选择了特征峰离子。我们在此过滤条件下筛选出484个差异变量。我们共鉴定了29种代谢物，其具体信息见表2。
表2 LC-MS鉴定的差异代谢物列表
4. 差异代谢物和代谢途径分析
我们通过热图分析了29种不同代谢产物的表达丰度。结果如图3所示。与PMR-T组相比，PMR-ILI组有14种差异代谢物上调，15种差异代谢物下调。
图3 差异代谢物表达丰度热图分析
我们使用Metaboanalyst 3.0分析了29种不同代谢产物的代谢途径。结果如图4所示，主要包括甘油磷脂代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、鞘脂代谢和色氨酸代谢。
图4 代谢途径分析
（颜色代表p值，颜色越浅，越显著；圆圈的大小代表富集结果中差异基因的数量，数量越大，圆圈越大）。
5. 关键差异代谢物筛选
为了筛选出与临床肝损伤指标直接相关的差异代谢物，我们对29种不同代谢产物和8种临床肝损伤指标进行了Spearman相关性分析。从相关热图（图5A）中可以看出，12种差异代谢物与4种以上的肝损伤指标存在大量显著差异，12种差异表达代谢物被确定为与临床肝损伤指标相关的潜在关键差异代谢物。
由于代谢组学数据的复杂性，在代谢组学分析中采用有效的数据分析和模式识别方法至关重要。随机森林不仅可以有效地探索样本代谢物的差异，还可以提供变量之间的相互作用关系，帮助寻找潜在的生物标志物。我们通过随机森林筛选了29种差异代谢物的差异变量的显著性（图5B），15种差异代谢物被鉴定为两组之间的高度差异。
我们结合spearman相关分析和随机森林筛选了8种不同的代谢产物，即胆碱、次黄嘌呤、牛磺胆酸、脱氧胆酸、phenylanylphenylalanine、LysoPC（18:1（9z）/0:0）、LysoPC（P-16:0/0:0）和D-谷氨酸。这八种代谢产物不仅与临床PMR-ILI病例的指标密切相关，而且是PMR-ILII组和PMR-T组之间高度差异的重要代谢产物，被确定为潜在的生物标志物。
图5 不同代谢产物与肝损伤指数的相关性分析（A）和随机森林分析（B）
（两组之间比较，*表示：p < 0.05，**表示：p < 0.01；*表示：4个或更多肝损伤指数存在显著差异）。
6. 生物标志物分析
受试者操作特征曲线（ROC）可用于判断某一因素是否对疾病的诊断具有判别价值。AUC（曲线下面积）用于指示预测准确性。AUC值越高，即曲线下面积越大，预测准确性越高。曲线越靠近左上角（X越小，Y越大），预测准确性越高。ROC分析了第5节中筛选的8个潜在生物标志物，结果如图6所示。LysoPC（18:1（9z）/0:0）、胆碱、D-谷氨酸、phenylanylphenylalanine和脱氧胆酸的AUC值小于0.5，次黄嘌呤的AUC为0.974，相应的最佳边界值为0.846（灵敏性为1.000，特异性为0.846）。这表明两组之间的差异非常明显，边界非常清晰，这也与样本量小有关。次黄嘌呤、LysoPC（P-16:0/0:0）和牛磺脱氧胆酸对临床PMR-ILI具有较高的诊断准确性，对临床早期诊断具有重要意义。我们后续需要测试更多样本。三种生物标志物的丰度变化趋势如图7所示。从图7可以看出，肝损伤组三种生物标志物的含量高于耐受组，有利于诊断和检测。
图6 ROC曲线分析（横坐标x轴为1-特异性，也称为假阳性率（假阳性率）。x轴越接近零，准确性越高；纵坐标的Y轴称为灵敏度，也称为真阳性率（灵敏度）。y轴越大，准确性越好。
表3 ROC分析结果
**：p < 0.01。最佳边界值是特异性和灵敏性的最高值。截止值是判断是否发生肝损伤的生物标志物丰度的临界值。
图7 与PMR肝损伤诊断相关的三种潜在生物标志物的丰度变化
讨论
识别新的潜在血浆生物标志物对预测PMRILI风险非常重要。然而，由于研究队列或诊断性能有限，目前尚未将生物标志物候选分子转化为临床应用。本研究通过比较PMR-ILI和PMR-T组，基于LC-MS代谢组学分析，直接揭示了与PMR-ILII相关的不同代谢组学特征。结果表明，两组之间的代谢谱明显不同。然后，通过结合临床肝损伤指标、贡献程度、变量的灵敏性和特异性，确定了具有PMRILI临床诊断价值的三种生物标志物，即次黄嘌呤、LysoPC（P-16:0/0:0）和牛磺脱氧胆酸，它们具有较高的灵敏性和准确性。
目前，对PMR-ILI生物标志物的研究主要集中在大鼠样本上，对临床PMR-ILII样本的研究很少。Dong等人发现，PMR给药42天后，大鼠胆汁和血清中9种胆汁酸的含量发生变化，肝损伤时甘氨酸脱氧胆酸、猪脱氧胆酸显著降低。Zhang等人发现，对照大鼠和用不同PMR提取物处理的大鼠血清和肝组织中的代谢产物不同。与对照组相比，PMR乙醇提取物和PMR水提取物处理的大鼠血清和肝组织中的能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢途径紊乱。乙醇提取物引起的紊乱比水提取物引起的更严重。Li等人发现，在LPS诱导的免疫应激下，何首乌乙酸乙酯提取物对大鼠肝脏造成明显损害，并鉴定了21种差异表达的生物标志物，主要涉及两种途径（三羧酸循环和鞘脂代谢）。Ma等人使用LC-MS测定PMR处理大鼠的动态血清代谢指纹，并筛选出六种潜在的生物标志物。给药一周后，生物标志物含量有显著变化，比谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）更敏感。然而，由于PMR-ILI的特异性特征尚未得到明确研究，而且人和大鼠之间的代谢存在很大差异，目前还没有符合临床表现的动物模型。本研究结果表明，与PMR-T相比，PMR-ILI患者的氨基酸代谢、脂质代谢和胆汁酸代谢异常，并在与临床PMR-ILII相关后筛选出三种敏感的生物标志物。
次黄嘌呤在体内被酶黄嘌呤氧化酶（XO）和鸟嘌呤脱氨酶转化为黄嘌呤，黄嘌呤被XO氧化为尿酸。血浆尿酸水平升高已被广泛认为是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的危险因素，氧化应激和炎症在该疾病的病理生理学中起着重要作用。有研究表明，喂食高胆固醇/甘油三酯饮食的实验动物的肝细胞显示次黄嘌呤增加。也就是说，次黄嘌呤的水平与肝损伤之间存在一定的关系，但所涉及的完整分子机制仍然未知。此外，最近的研究表明次黄嘌呤在生物体的能量功能代谢中起着一定的作用，如三羧酸循环和ATP的形成，而肝脏是次黄嘌呤的主要代谢部位。此外，一些研究表明，次黄嘌呤处理后，大鼠血清AST和ALT活性显著升高。次黄嘌呤作为嘌呤代谢的重要中间产物，在大量积累时会作用于过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）和脂蛋白脂酶（LPL），从而干扰脂质代谢，甚至对肝实质造成损害。
LysoPC（P-16:0/0:0）属于溶血磷脂（LyP），是一种单甘油磷脂，是甘油磷脂代谢的重要代谢产物。甘油磷脂是体内最丰富的磷脂。它是胆汁和膜表面活性剂的重要成分，参与细胞膜对蛋白质的识别和信号转导。与耐受组相比，LysoPC（P-16:0/0:0）在出现肝损伤的PMR-ILI组中显著过表达。LyP的变化反映了早期肝损伤时膜磷脂酰胆碱的快速转化。据报道，LysoPC（P-16:0/0:0）参与广泛的免疫调节生物学过程，如细胞增殖和炎症。LysoPC（P-16:0/0:0）作为一种饱和LyP，作为一种有效的炎症介质，可诱导释放促炎细胞因子，如IL-6和IL-8。LyP诱导炎症因子的机制也与核转录因子κB（NF-κB）、Notch和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路有关。LyP是几种肝病（如药物诱导的肝磷脂变性和非酒精性脂肪肝）的生物标志物。与本研究一致，病理条件下溶血磷脂酰胆碱（LPC）水平更高。
初级胆汁酸生物合成途径也与PMR诱导的肝损伤有关。在我们的研究中，与耐受组相比，肝损伤组中牛磺脱氧胆酸的水平显著升高。胆汁酸代谢异常也是PMR引起的肝损伤患者的特征之一。许多关于胆汁酸靶向代谢组学的研究有望通过早期胆汁酸代谢异常来判断何首乌肝损伤的发生。Ma等人通过LC-MS分析了38名药物性肝损伤患者和30名健康对照的血清代谢组和15种靶向胆汁酸代谢产物，发现药物性肝损害患者的牛磺胆酸水平显著高于健康对照，这与本研究的结果一致。Xie等人使用靶向代谢组学来识别和量化可预测药物诱导肝损伤严重程度的特定类型的胆汁酸，结果表明牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）是区分严重药物诱导肝损害患者和较轻患者的独立风险因素，并有可能预测药物诱导的肝损伤严重度。据报道，牛磺酸脱氧胆酸可激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）介导的生存途径，从而导致肝损伤和肝细胞凋亡。此外，牛磺胆酸本身在肝损伤中也有明显作用。据报道，静脉注射牛磺脱氧胆酸（10 μmol/100 g）后，AST和ALT水平在很大程度上升高，肝细胞线粒体脂质过氧化增加，并发生胆汁淤积性损伤。
然而，这项工作中研究的案例数量相对较少，结果需要更大的样本量来验证。PMR-ILI是一种罕见但潜在严重的药物不良反应，即只有一小部分人在服用治疗剂量的PMR后发生肝毒性。此外，随着PMR-ILI的报告，PMR的临床使用频率和剂量减少。所有这些都使得我们难以收集大量PMR-ILI临床病例。此外，临床上使用的PMR有两种：未炮制的PMR和炮制的PMR，这两种PMR在中医中都广泛使用。由于未炮制的PMR和炮制的PMR都可能导致PMR-ILI，且未炮制PMR和炮制的PMR导致肝损伤的成分和机制相似，我们将未炮制的和炮制的PMR的样本合并以扩大样本量（表1中提供的每名患者使用的PMR的类型和剂量）。对于特异性疾病研究，小样本量的结果也具有重要意义。例如，Zhang等人研究了PMR-ILI病例的风险分析，其中6名患者在摄入PMR后肝功能测试异常。在我们的研究中，PMR-ILI组的样本数量很少（n = 6），但结果具有一定的意义，可以为后续研究提供基础。分析结果表明，PMR-T组和PMR-ILI组之间的差异较大，但组内差异较小。从这些差异代谢物筛选中获得的生物标志物具有重要意义。在这项研究中，我们还为筛选其他临床疾病的生物标志物提供了一个例子，同时考虑了变量的贡献及其与肝损伤之间的关系。
结论
本研究中，我们收集了6份PMR-ILI和13份PMR-T临床血浆样品，并基于LC-MS对PMR-ILI和PMR-T的临床血浆样品进行了代谢组学分析，通过与肝损伤指数进行相关性分析和随机森林筛选以及ROC分析，最终选择了何首乌临床肝损伤的三种生物标志物：次黄嘌呤、LysoPC（P-16:0/0:0）和牛磺脱氧胆酸，该研究结果为PMR进一步的临床应用提供了基础。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36758914/
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