导读
脑微梗死（cerebral microinfarcts，CMIs）的特征是小血管的零星阻塞导致神经元死亡，与认知障碍的风险增加有关，与大梗死相比可能具有不同的危险因素。CMIs发病率高，社会负担重。因此，在临床上提供合理的治疗方案至关重要。但目前关于CMIs发生机制及治疗的研究相对较少，且文献几乎都是以老年患者为研究对象，研究多基于尸检或影像学研究的社区或医院文献。补阳还五汤(BYHW)是一种传统的中药方剂，长期以来被用于治疗中风和中风相关疾病，是我国治疗缺血性或出血性脑卒中最常用的药物之一。尽管在补阳还五汤在人类大脑保护方面取得了一定效果，但其治疗作用的分子基础尚未得到明确的阐明。在本研究中，我们假设补阳还五汤激活PKA / CREB通路逆转线粒体功能障碍，抑制细胞凋亡，从而改善微梗死诱导的认知功能障碍。我们应用微球诱导的大鼠CMI模型来研究CMIs的行为学和分子后果，并确定BYHW水煎剂如何改善CMIs。随后利用Morris水迷宫、定量蛋白质组学、免疫组织化学等分子检测手段，发现补阳还五汤治疗激活PKA/CREB通路可能逆转线粒体功能障碍，抑制海马神经元凋亡，改善CMI诱导的大鼠认知功能障碍。总之，这些发现证实了补阳还五汤在治疗CMIs诱导的认知障碍方面的治疗潜力，并深入挖掘了其可能的作用机制。
论文ID
原名：BYHW Decoction Improves Cognitive Impairments in Rats with Cerebral Microinfarcts via Activation of the PKA/CREB Pathway
译名：补阳还五汤通过激活PKA/CREB通路改善脑微梗死大鼠认知障碍
期刊：Oxidative Medicine and Cellular Longevity
IF：7.310
发表时间：2022.12
通讯作者：刘建勋、高颖
通讯作者单位：中国中医科学院西苑医院基础医学研究所、北京中医药大学脑疾病研究所、北京中医药大学东直门医院，西悉尼大学NICM健康研究所
实验设计
实验结果
脑微梗死( cerebral microinfarcts，CMIs )是在神经病理检查中可见的小的缺血病灶，可以通过高场强磁共振成像进行检测。CMIs常见于血管性痴呆(加权平均62 %)、阿尔茨海默病（43 %）、阿尔茨海默病合并脑血管病变的痴呆患者(33 %)。
在本研究中，我们假设补阳还五汤激活PKA / CREB通路逆转线粒体功能障碍，抑制细胞凋亡，从而改善微梗死诱导的认知功能障碍。为了验证这一假设，我们利用微球诱导的CMI模型，进行了行为学、分子学和生物信息学的检测和分析（CMI模型和补阳还五汤治疗的时间线如图1所示）。
图1. CMI模型、补阳还五汤治疗及行为学检测的时间线
GS：握力；RP：旋转杆；MWM：Morris水迷宫
1. 补阳还五汤中生物活性成分的定量分析
采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC - MS/MS）测定补阳还五汤中代表性化学成分的含量。图2为补阳还五汤主要指标性成分的色谱图，MS1和MS2的原始图像见附图1。表1中确定了各成分的校正曲线方程和定量限，所有校正曲线均呈现良好的线性回归(R2大于0.99 )。利用表2中内标物的校准曲线计算了主要化合物的浓度。
图2. 补阳还五汤( b )中主要化合物的混合标准曲线(a)和代表性质谱图(b)的多反应监测(MRM)叠加：(1)苦杏仁苷，(2)羟基红花黄色素A，(3)芍药苷，(4)阿魏酸，(5)洋川芎内酯I，(6)洋川芎内酯H，(7)苯甲酰芍药苷，(8)芒柄花素，(9)黄芪甲苷IV。
表1. 用校正曲线的线性范围、R2和定量限确定主要鉴定化合物
表2. 补阳还五汤中主要鉴定化合物的含量
2. 补阳还五汤改善CMI诱导的认知和运动功能障碍
为了探讨补阳还五汤是否可以减轻CMI相关的认知功能障碍，我们在CMI损伤后第5周和第6周使用Morris水迷宫检测认知功能。60只CMIs大鼠平均分为4组，分别灌胃生理盐水(the Vehicle control)、25.2 mg/kg EGb761(银杏叶提取物)(the positive control))、3.78 g/kg BYHW煎液和7.56 g/kg BYHW煎液。另外，15只假手术大鼠用生理盐水处理(Sham组)。每天同一时间重复给药1次，连续6周。在训练期间，Vehicle组大鼠定位隐藏平台的潜伏期持续延长，它们更多地沿着池壁移动，直到第5天，也就是(空间学习阶段)训练的最后一天；其潜伏期时间是Sham组的3.14倍(图3 ( b ) )。而补阳还五汤各治疗组大鼠即使在训练第2天也能较快找到平台，潜伏期的差异在第5天最为明显。与Vehicle组相比，3.78 g/kg和7.56 g/g BYHW水煎剂处理组的潜伏期分别缩短了50 %以上(图3 (b))。
为了进一步探讨补阳还五汤治疗是否可以减轻CMI相关的行为损害，我们在Morris水迷宫测试之前使用了握力和转棒测试。我们发现补阳还五汤治疗可减轻CMI诱导的精神运动不协调和肢体肌张力障碍(图3 (d)和3 (e))。在随后的无平台(评估空间记忆)的探测实验中，这些Vehicle组大鼠没有表现出对目标平台位置的回忆。他们在池的外围花费了更多的时间，平均只穿越了两次目标环区。服用补阳还五汤的大鼠表现较好(图3 ( c ) )。以上结果表明，补阳还五汤治疗有效地减轻了CMI诱导的大鼠认知和行为损伤。
图3. 补阳还五汤抑制CMI诱导的认知和行为损害
(a) Morris水迷宫任务训练期(空间学习阶段)游泳轨迹的代表性
。(b) Morris水迷宫训练期间连续几天到达隐藏平台(平台潜伏期)所需时间及第5天结果量化（n=7-11）。(c)空间探索实验中靶环穿越次数(大鼠)。(d，e)通过握力(n=7-9)和转棒实验((n=5-7)检测补阳还五汤治疗对影响CMI损伤大鼠力量和运动平衡的影响。数值以（均值±标准差）表示，并通过单因素方差分析( one-way ANOVA )进行分析。
3. 补阳还五汤减轻CMI诱导的神经元损伤
为了确定补阳还五汤对CMI诱导的认知障碍保护作用的潜在机制，我们通过组织学检查研究了补阳还五汤治疗后细胞形态和数量的变化。如图4 ( a )所示，在紫外光激发下出现的荧光点证实了微球进入了许多不同脑区的小动脉或微动脉。HE染色显示Sham组神经元结构完整，细胞核呈圆形且清晰，而CMI损伤的大鼠神经元结构较差，呈锥体形，细胞核皱缩。CMI损伤也导致细胞数量明显减少。经过6周的治疗，发现补阳还五汤可以减轻这些病理特征，表现为神经元形态、组织和数量的改善(图4 ( b ) )。采用TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling)法检测补阳还五汤对缺血诱导的海马细胞凋亡的神经保护作用。与Sham组相比，CMIs损伤的大鼠( Vehicle组)显示出更高比例的TUNEL阳性神经元。与Vehicle组相比，3.78和7.56 g / kg BYHW水煎液处理的动物海马TUNEL染色的凋亡细胞比例减少(图4 ( c ) )。总之，我们的组织学结果清楚地证明了补阳还五汤对神经元的抗凋亡作用，这有助于在细胞水平上解释其对认知障碍的神经保护作用。
图4. 补阳还五汤在CMI模型中的作用
( a ) CMI损伤及3.78或7.56 g / kg BYHW水煎剂给药6周后大鼠全脑的代表性图像。CMI手术期间，除Sham组外，其余各组均注射0.2 mL荧光微球。在紫外光激发下获取图像，使微球可视化，确保模型成功。( b )补阳还五汤对海马区细胞形态和数量的影响。从CA1 (标尺, 1 mm)相同区域显示有代表性的图像，在10倍放大倍数下计数细胞数。每只大鼠的数值由四个不同切片(n=3)的平均值确定。( c )海马TUNEL染色代表性图像(标尺，1 mm)显示凋亡细胞(棕色细胞核)。海马区凋亡神经元数量的定量分析见柱状图(n=3)。海马区凋亡神经元数量的定量分析见柱状图(n=3)。数据采用单因素方差分析。
4. 补阳还五汤对CMI损伤大鼠线粒体功能和形态具有保护作用
已知线粒体复合物在缺血损伤后会发生损伤，导致能量耗竭、过量ROS生成和细胞凋亡。我们检测了CMI损伤大鼠的线粒体膜电位( mitochondrial membrane potential，ΔΨm )和线粒体复合物活性，探讨补阳还五汤对线粒体功能的影响。与Sham组相比，CMIs损伤的大鼠表现出更低损伤的ΔΨm。7.56 g/kg BYHW水煎液给药组的ΔΨm比Vehicle组增加了1.51倍(图5 ( a ) )。此外，我们从大鼠海马中分离线粒体并用Seahorse XF-96分析仪测量其OCR。利用各种线粒体复合物底物和抑制剂，我们发现CMIs引发了复合物活性的明显下降。具体来说，补阳还五汤治疗组复合物I活性是Vehicle组的1.0-1.8倍(图5 ( b ) )。
此外，Vehicle组观察到的线粒体形态的改变在给予BYHW汤治疗的各组中被逆转，具体表现为线粒体嵴数量更多，形态更清晰(图5 ( d ) )。
总之，这些数据揭示了补阳还五汤对CMI诱导的细胞凋亡的神经保护作用可能涉及其对线粒体复合物功能的保护作用。
图5. 补阳还五汤可减轻CMI诱导的大鼠海马神经元线粒体损伤
( a ) JC - 1共培养体系中线粒体膜电位( mitochondrial membrane potential，ΔΨm)的代表性流式细胞数据。JC - 1荧光显示为红绿比，其中聚合形式为红色，表明膜电位较高，单体形式为绿色，表明膜电位较低(n=3)。( b )在大鼠海马新鲜分离的线粒体中，通过OCR测定线粒体复合物活性。鱼藤酮、琥珀酸、抗霉素A ( AA )和抗坏血酸+ TMPD注射前后OCR的变化揭示了复合物I (在5.8 ~ 16 min之间)、复合物II / III (在16 - 26.2 min之间)和复合物IV (在36.5 - 46.6 min之间) (n=3)的活性。( c )将分离的线粒体在含有鱼藤酮、琥珀酸和ADP的MAS溶液中孵育。复合物V的活性通过注射复合物V抑制剂寡霉素前后，OCR在5.8 ~ 16 min (n=3)之间的变化来评价。采用ATPlite试剂盒(n=3)和H2DCFDA荧光探针(n=3)测定海马组织中ATP和ROS水平。( d )海马区缺血神经元超微结构检查的代表性图像。线粒体在30，000 ×图像中用红色箭头标记，在60，000 ×图像(大鼠)中显示放大。使用Graph Pad Prism软件进行分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与Vehicle组进行单因素方差分析进行统计学比较。
5. 使用蛋白质组学技术和平行反应监测( parallel reaction monitoring，PRM )评估补阳还五汤对海马的调节作用
为了阐明补阳还五汤逆转线粒体复合物功能障碍的调控机制，我们利用蛋白质组学技术研究了Sham、Vehicle和7.56 g / kg补阳还五汤组大鼠海马中蛋白质表达的变化(图6 ( a ) )。我们使用非标记定量蛋白质组学技术来研究海马蛋白质的全局变化。在海马中检测到的3500个蛋白质中，有823个被鉴定为丰度差异蛋白质( different abundant proteins，DAPs )，这些蛋白质被CMIs改变至少1.5倍，并通过补阳还五汤治疗恢复。DAPs的生物信息学和功能富集分析揭示了多个生物学过程。其中，CREB相关蛋白被发现受到补阳还五汤的密切调控。热图显示了这些CREB相关的信号通路，包括cAMP - PKA、Ras - MAPK和PI3K - AKT通路(图6 ( b ) )。
此外，我们进行了靶向蛋白质组学研究PRM，以验证CREB相关蛋白的表达。与蛋白质组学结果一致，PRM发现在CMI模型中，PKA、AKT和Ppp1r，以及cAMP - PKA和PI3K - AKT通路相关蛋白的表达发生了改变，并且在补阳还五汤治疗后表达水平恢复(图6 ( d ) )。这些数据加强了我们的假设，即补阳还五汤通过PKA/CREB通路来调节其对线粒体功能的影响。
图6. 通过蛋白质组学分析和平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)评估补阳还五汤对信号通路调控的影响
( a )工作流程：补阳还五汤治疗6周后，采用定量蛋白质组学技术对各组大鼠海马细胞进行全蛋白质组分析。从大鼠脑中分离海马，用胰蛋白酶消化，然后进行UPLC - MS / MS分析。所得的UPLC - MS / MS数据用于鉴定样品中存在的肽(推断为蛋白质)。最后，通过Label - free和PRM分析对初步结果进行验证，确认目标蛋白的表达水平。( b )利用STRING数据库分析CREB相关DAPs的蛋白互作网络。在这里，彩色圆圈代表与CREB相关的不同通路中的一组基因。蛋白相互作用图显示了CREB相关蛋白的网络，包括cAMP - PKA (绿色圈)、Ras - MAPK (红色圈)、PI3K - AKT (蓝色圈)。基因圆圈的不同大小(从小到大)和深浅(从光到暗)代表了补阳还五汤(从弱到强)的调控程度。( c )热图显示不同组别中CREB相关蛋白的表达水平。颜色深度代表从红色(上调)到蓝色(下调)的组间表达差异。( d )利用PRM验证特异性CREB相关蛋白(具体为Ppp1r1b、PKA和AKT)的表达谱。确定了不同组蛋白的特异性肽段，可用于预测目的基因。通过整合前体离子的所有峰面积，生成不同组别蛋白质的柱子(n=3)。
6. 补阳还五汤对PKA/CREB信号通路的影响
为了实验检测补阳还五汤对PKA/CREB通路的影响，我们测定了各治疗组PKA和CREB的表达和活性。免疫组化检测显示，与CMI损伤组相比，补阳还五汤治疗后PKA表达和活性( p-PKA )上调。PKA主要在细胞质和突触中表达，在线粒体中也有表达。我们发现，CMIs诱导了神经元胞浆和突触中PKA表达和活性的下降，而补阳还五汤治疗逆转了这种下降(图7 ( a ) )。与PKA不同，CREB的细胞分布既包括细胞质和细胞核，也包括线粒体。我们发现Vehicle组的CREB表达与其他组无明显差异(图7 ( b ) )。然而，与Sham组相比，CMIs损伤大鼠的CREB ( p-CREB )活性降低。补阳还五汤给药部分逆转了这种下降，表明CREB的活性受PKA的调节，补阳还五汤可能通过激活PKA/CREB通路保护线粒体。此外，我们发现补阳还五汤治疗后，PKA上游分子cAMP水平也升高(图7 ( c ) )。
以上结果表明，补阳还五汤减轻了CMIs导致的线粒体损伤，并且CMI诱导的PKA和CREB活性下降被补阳还五汤治疗逆转。因此，我们推测补阳还五汤的有益作用是通过对PKA/CREB信号通路的去抑制而产生的。为了支持这一假设，进一步实验发现PKA抑制剂H - 89在体外部分抑制了补阳还五汤对神经元凋亡和线粒体损伤的影响，以及ATP和ROS含量，表明PKA/CREB信号直接调节补阳还五汤处理后的线粒体活性(图7 ( d ) ~ 7 ( g ) )。
综上所述，蛋白组学分析、免疫组织化学和流式细胞术的数据表明，补阳还五汤在CMIs后发挥神经保护作用的机制包括激活大鼠海马线粒体PKA/CREB信号通路。
图7. 免疫组化法测定补阳还五汤对CREB相关蛋白活性及表达的影响( a , b)
大鼠海马(标尺, 1 mm)中PKA和CREB的免疫组化可视化和定量。海马(n=3) CREB和PKA平均光密度值。( c )用ELISA试剂盒测定海马CAMP含量，并与Vehicle组(n=4)进行比较。( d-g )补阳还五汤对线粒体损伤( Mito Tracker红/绿)、( e )神经元凋亡( Annexin V-FITC/PI)、ROS和ATP生成的影响，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与Vehicle组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001与BYHWD + H - 89组比较。
讨论
CMIs是指一组与认知障碍和痴呆相关的小的缺血性病变。我们的研究旨在探索这种传统中药作为治疗CMIs等难治性疾病的治疗策略的可行性。补阳还五汤( BYHW )是我国最常用的中医中药治疗脑卒中的药物，有研究报道其可以改善脑卒中后认知障碍。补阳还五汤在我国广泛用于治疗中风及中风后病症，大量动物及临床试验都证实了其有效性。一项荟萃分析评估了56项研究，其中包括1270个动物，研究表明补阳还五汤在局灶性脑缺血模型中具有显著的神经保护作用。其机制可能与抗炎、抗氧化、调节VEGF或血管生成素- 1表达、改善突触可塑性有关。临床研究也证明了补阳还五汤治疗中风的有效性。此外，补阳还五汤对卒中后癫痫、卒中后疲劳、卒中后痴呆等卒中后情况也显示出有益的作用。本研究提供了新的证据，表明补阳还五汤治疗可以帮助CMIs患者在认知和运动能力方面获益。此外，我们发现PKA/CREB的激活保护线粒体复合物，产生更多的ATP和更少的ROS，最终减少神经元凋亡是补阳还五汤对大鼠CMI保护作用的关键机制。此外，我们采用体外培养的原代神经元氧糖剥夺( oxygen and glucose deprivation，OGD )缺血损伤模型，证实补阳还五汤可显著降低线粒体(附图2)中ROS水平。
线粒体损伤是脑缺血损伤发生发展的关键事件。潜在的原因可能涉及线粒体复合物I的构象变化。事实上，据报道，在脑缺血过程中，有活性的线粒体复合物I向失活的形式转变，而失活的复合物I不能产生足够的ATP，即使它催化更多的NADH到NAD+。此外，还有一种正电子发射断层扫描（PET）影像探针，用于监测线粒体复合物的活性，以确定缺血性脑卒中的病理进展和评估潜在治疗剂的效果。在本研究中，我们发现补阳还五汤治疗逆转了大鼠海马线粒体复合物功能障碍和ATP生成增加，这有助于增加神经元存活和改善认知功能。
利用定量蛋白质组学，我们注意到与PKA/CREB通路相关的蛋白受到补阳还五汤的影响，这与其有益作用相一致。大量的动物研究表明CREB在记忆和认知功能中发挥重要作用，而PKA是调节CREB活性的上游激酶。我们发现补阳还五汤处理上调了PKA/CREB通路中PKA和CREB等蛋白的表达。体外实验结果显示，补阳还五汤对细胞凋亡、线粒体损伤以及ATP和ROS含量的保护作用被PKA抑制剂H - 89部分阻断，表明补阳还五汤通过激活PKA/CREB通路保护线粒体(图7 ( d ) - 7 ( g ) )。然而，CREB的调节激酶不仅包括PKA，还包括MAPK、AKT和Ca MKII. 与之一致的是，我们的蛋白质组学分析发现AKT和MAPK通路也受到补阳还五汤的调节(图5 ( a ) )。进一步，我们利用PRM验证了补阳还五汤对CREB相关蛋白AKT的调控作用(图5 ( b ) )。由于我们的蛋白质组学和PRM分析也突出了Akt/CREB通路，它代表了BYHW汤作用的另一个潜在机制。这一推测需要进一步验证。总之，我们的结果表明PKA/CREB是补阳还五汤改变的通路之一，但不是唯一的通路。
CHRM1、RAPTOR、GABBR、COL1A这4个基因的表达水平与其余4个基因的表达水平相反，Vehicle组较Sham组升高，经补阳还五汤治疗6周后降低，见图5 ( b )、5 ( c )。这些基因参与蛋白质合成和认知功能。这些基因的表达量在CMI损伤组由于机体在缺血压力下的调控而急剧升高，并持续较长时间(至少6周)。但在治疗6周后，补阳还五汤组这些基因表达下降，可能是由于补阳还五汤治疗改变了缺血压力和脑损伤的情况。在今后的研究中，我们将验证这些有趣的结果，并考察补阳还五汤对这些非典型基因的具体影响。
我们的数据显示，与Vehicle处理的大鼠相比，BYHW处理后cAMP水平也增加(图6 ( d ) )。这一结果增加了补阳还五汤作用机制的复杂性。由于PKA是cAMP依赖性激酶，其活性依赖于细胞内cAMP的水平，上述发现提示补阳还五汤在CMIs中PKA / CREB介导的作用可能部分源于对cAMP的影响。类似地，补阳还五汤可能不直接作用于PKA或AKT，而是通过与上游蛋白如腺苷酸环化酶( AC )、Gs蛋白或抑制磷酸二酯酶( PDE )等相互作用来调节cAMP水平，进而影响PKA和CREB活性。然而，BYHW汤的确切作用点还需要更多的聚焦实验来证实。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36620084/
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