论文ID
题目：Base editing correction of hypertrophic cardiomyopathy in human cardiomyocytes and humanized mice
期刊：Nature Medicine
IF：87.241
发表时间：2023年2月16日
通讯作者单位：德克萨斯大学
DOI：https://doi.org/10.1038/s41591-022-02176-5
论文ID
题目：Efficient in vivo genome editing prevents hypertrophic cardiomyopathy in mice
期刊：Nature Medicine
IF：87.241
发表时间：2023年2月16日
通讯作者单位：哈佛医学院
DOI：https://doi.org/10.1038/s41591-022-02190-7
主要内容：
肥厚型心肌病临床前模型中的症状前基因编辑显示出治疗前景；现在需要进行临床研究以评估人类的安全性和有效性。
肥厚型心肌病（HCM）是一种原发性心脏疾病，其特点是心肌异常增厚，由编码肉瘤蛋白的基因中的杂合致病变体引起。HCM通常在年轻时出现，可发展为心衰、心律失常和心脏猝死。治疗方案有限，包括抗心律失常药物、植入式除颤器和心脏移植。基于精确的治疗方法也已经出现，最引人注目的是心脏肌球蛋白抑制剂mavacamten，它针对的是被认为是驱动HCM的病理高收缩性，但也导致了心力衰竭风险的增加。体内CRISPR基因编辑正在成为人类疾病的一种潜在治疗选择，最明显的是转甲状腺素淀粉样变、癌症、血液病和失明综合征。在本期《自然医学》杂志上发表的配对论文中，Reichart等人和Chai等人报告了基于基因编辑的新精准疗法的临床前研究，以预先纠正一个HCM的致病变体（图1）。
这两个小组使用不同但互补的方法，涉及CRISPR-Cas9腺嘌呤碱基编辑（ABE），以MYH7基因中一个已被研究的错义变体（c.1208G>A；p.Arg403Gln）为目标。这种致病变体通过显性阴性机制增加了肌体的收缩性；因此基因治疗需要等位基因的纠正或敲除。尽管ABE可以实现高效和精确的校正，但它仅限于将腺嘌呤编辑成鸟嘌呤使基因恢复到野生型功能的情况，以及目标腺嘌呤位于一个 "窗口 "内，即碱基编辑器用来接触基因组位点的protospacer adjacent motif（PAM）的上游的确定距离。重要的是，该区域内的非目标腺嘌呤会受到旁观者编辑的影响，从而引入新的致病变体。
Chai等人确定了一种变体ABE和引导RNA（gRNA），在体外测试时能最大限度地对p.Arg403Gln变体进行靶向编辑，最大限度地减少旁观者编辑，并挽救了体外HCM系统中的许多病理学变化。为了测试体内的编辑效率和表型拯救，该小组开发了一种新型的MYH7 p.Arg403Gln变体的人源化小鼠模型，以便直接测试为人类应用开发的gRNA。在这个模型中，杂合子人源化小鼠在9个月大时出现心室肥大和纤维化，而同合子小鼠出现明显的心肌病和纤维化，并在出生后1周左右死亡。Chai等人使用腺相关病毒载体（AAV）AAV9来传递ABE和gRNA，通过使用心脏肌钙蛋白T（cTnT）启动子来限制对心肌细胞的表达。在同型小鼠出生后的第一天向其胸腔内注射高剂量的载体，使其在转录物水平上得到约35%的纠正，并使其寿命延长到2周。在杂合子小鼠中，与未经治疗的小鼠相比，治疗达到了类似的矫正效果，并在生命的16周内挽救了左心室肥厚和重塑。没有检测到旁观者或脱靶的RNA编辑。
Reichart等人使用类似的基于AAV的策略来传递ABE和由心肌细胞特异性鸡TNNT2启动子驱动的gRNA，以纠正无症状前小鼠的同一致病变体。与Chai等人不同的是，他们使用了一个成熟的（但非人类化的）小鼠模型，其中致病变体存在于Myh6小鼠基因座的正交位置--这不允许测试人类特异性gRNAs。在129SvEv遗传背景下，雄性小鼠在20至25周之间出现心肌病，在出生后10-13天的治疗（使用小鼠特异性gRNAs）导致心室心肌细胞中约68%的转录物纠正，心房心肌细胞中26-39%的转录物纠正。出生后32-34周的测试表明，心脏肥大得到了挽救，心脏纤维化得到了改善，失调的基因表达正常化。检测到了旁观者的编辑，并随着AAV的连续注射而增加，这可能部分是由于选择了一种具有广泛编辑窗口的ABE和一种不太特异的PAM，促进了与基因组中许多位点的接触。
作为另一种方法，Reichart等人使用金黄色葡萄球菌Cas9，它引入双链DNA断裂（与ABEs相反）来选择性地灭活致病的p.Arg403Gln等位基因。功能测试显示了有效的编辑和对肥大表型的拯救；然而，更高的剂量也有收缩功能的降低，反映了心肌细胞中野生型等位基因的无意编辑，并强调了如果要采用这种方法，治疗窗口的狭窄。
Chai等人8和Reichart等人的研究结果为HCM模型的成功基因编辑提供了有希望的概念证明；然而，将其转化为人类患者需要克服各种挑战。两项研究都没有明确解决ABE在临床发病后阻止或逆转心肌病表型的能力（Chai等人8在同型人化小鼠中外围解决了这个问题，但这种基因型并不代表人类疾病）。这可以通过在心肌病发生后对小鼠进行治疗并评估编辑效率和表型拯救来解决。许多剩余的问题需要进行人体临床试验；例如，确定疗效所需的编辑阈值，不完全编辑和功能性 "心脏嵌合 "是否会产生不良影响（如心律失常），以及评估高病毒载体剂量和ABE长期表达的毒性和免疫原性。特别是后者已被证明是用AAV CRISPR疗法治疗大型动物的一个问题。
对HCM这样的遗传异质性疾病进行体内基因组编辑还有其他挑战，如腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑的局限性和碱基对的限制，需要为每个因果变体确定一个新的gRNA，为每个变体提供适当位置的PAM有限，也许最重要的是，有可能出现旁观者编辑和非目标编辑。幸运的是，MYH7 p.Arg403Gln变异体的序列环境适合用现有的ABEs进行有效的纠正，也适合可接受的旁观者编辑，但并非所有的HCM变异体都能如此简单地解决。
尽管存在这些挑战，但单剂量明确的治疗方法不仅适用于HCM，也适用于基因敲除或过度表达策略不适用的众多其他遗传性综合征，因此是一个非常值得追求的目标。最直接的是，在患有晚期疾病的成人中进行第一阶段的临床试验将有助于澄清载体和编辑的安全性、毒性、免疫原性和编辑效率，并确定表型的可逆性和救援。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41591-022-02176-5
https://www.nature.com/articles/s41591-022-02190-7
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