原文题目：Isolation of extracellular fluids reveals novel secreted bioactive proteins from muscle and fat tissues
通讯作者：Bruce M. Spiegelman
隶属单位：丹娜—法伯癌症研究所癌症生物学系
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.12.014
从各种组织分泌的蛋白质可以介导器官间的串扰。这些分泌因子可以发挥有益或有害的作用，这取决于它们的浓度、组织和背景。分泌组可以通过寒冷暴露和运动等刺激来调节。因此，鉴定这些潜在有益的分泌蛋白具有极大的意义。尽管对来自组织的转录组学或蛋白质组学谱的计算分析可能部分用于此目的，但这种方法可能会错过许多分泌蛋白，其中分泌的变化不伴有mRNA水平的变化，并且分泌/脱落是非规范的。
图1 肌肉EF不同于肌肉组织和血清蛋白质组，可以作为肌肉组织中分泌蛋白的潜在发现工具
血清或血浆蛋白质组学分析是一种从各种不同组织中鉴定可能以内分泌方式起作用的新型分泌蛋白的工具。然而，尽管样品处理和仪器灵敏度方面取得了最新进展，但血清/血浆蛋白质组学仍然极具挑战性。这主要归因于蛋白质丰度的巨大变化，从mg / mL到pg / mL，即所谓的动态范围问题。事实上，血清和血浆中丰度最高的12种蛋白质约占总蛋白质含量的95%，这往往掩盖了对低丰度蛋白质（如激素和细胞因子）的检测。
以前的研究已经开发出通过富集低丰度蛋白质的技术来提高血清和血浆蛋白质组的质谱（MS）覆盖率，例如通过二维凝胶电泳分馏，免疫亲和减法程序，蛋白质富集技术，或这些方法的组合。然而，尽管做出了这些努力，MS覆盖率仍然很低，并且发现潜在的重要分子要么是不可能的，要么需要对初始样品进行复杂的处理，大量的MS仪器时间和/或基因修饰。
除营养物质外，细胞外液（EF）还含有信号分子，如分泌的蛋白质和代谢物。局部EF可以通过不同的技术进行采样，例如，植入灯芯，微量移液器和导管，或胶囊。EF分离的另一种常用方法是微透析，它已被用于各种组织。对皮肤EF的研究表明，血清中检测到的蛋白质中有83%也可以在EF中检测到，而50%的皮肤EF蛋白无法在血清中检测到。这表明EF可以作为识别新型细胞外和生物活性蛋白质的来源。在这里，研究人员假设来自组织的分泌蛋白质以及来自循环的某些蛋白质可以通过组织EF蛋白质组学检测到，此外，EF分析可以提供各自组织中细胞外蛋白质的更全面图像。虽然EF采样可以使用微透析和其他方法进行，植入需要手术干预，这本身会导致急性组织创伤并在植入部位诱导炎症反应。
图2急性运动训练重塑肌肉EF蛋白质组并影响凝血和补体级联的蛋白质
特别是，微透析的原理是基于物质在半透膜上的被动扩散。据报道，由于扩散和恢复有限，该技术遭受大分子损失。Wiig及其同事之前的一项研究开发了一种优雅的快速EF分离方法，该方法使用低速离心技术对肿瘤组织进行。该方法已被用于研究肿瘤和肌肉组织中的细胞外代谢组。此外，该技术已被应用于分析人卵巢癌EF的蛋白质组。然而，以前从未对肌肉或脂肪组织中这种快速分离的EF进行深入的蛋白质组学分析。在这里，研究人员开发了一种协议来分析EF蛋白质组，以响应肌肉和脂肪组织中的不同干预措施，从而发现以前未报道的脂肪因子和肌因子。
在这项研究中，研究人员开发了一种简单快速的EF蛋白质组分析方案。研究人员表明，这种方法可以适应不同的遗传和环境干预，例如运动，PGC1α的组织特异性转基因表达和寒冷暴露。它也适用于不同的组织，如肌肉和各种脂肪库。重要的是，事实证明EF蛋白质组的组成和复杂性与血清和组织的组成和复杂性不同。EF蛋白质组学方法大概也可以应用于许多其他组织，包括人类的组织。这可能导致新的生物标志物的开发，并为治疗干预提供潜在的新靶点。以前，已经开发了几种邻近生物素化系统来鉴定来自特定组织的分泌因子。Finkel小组开发了一种优雅的小鼠模型，称为分泌组小鼠，它在内质网（ER）腔内有条件地表达近端生物素化系统，导致通过常规分泌途径分泌的蛋白质的标记。
图 3肌肉特异性 PGC1α 表达重塑 EF 蛋白质组并揭示神经营养因子 prosaposin 的蛋白质水平升高
这些小鼠血清中分泌的蛋白质可以通过链霉亲和素纯化来富集。虽然高度特异性，但该系统需要耗时的育种，以及通过注射和生物素喂养达到的高生物素血浆水平。为了克服转基因小鼠耗时的育种步骤，已经开发出一种表达ER生物素连接酶的条件性腺相关病毒，可以在局部注射以标记来自特定组织的分泌蛋白。然而，EF的全蛋白质组分析（如此处所示）与这些方法相比有几个优点。EF方法快速简单，不需要任何基因操作，注射或喂食化学物质 - 所有这些都可能干扰疾病过程或影响体内平衡。
此外，研究人员的EF蛋白质组学工作流程允许检测不使用通过ER腔的传统分泌途径的蛋白质。尽管EF蛋白质组学方法已经允许鉴定许多分泌蛋白，但如图所示，可以通过添加糖苷酶的处理步骤来进一步拓宽。此步骤可以更好地对非常重的糖基化蛋白质（如肌因子鸢尾素）进行MS检测。许多这样的高度糖基化蛋白质存在于血浆或血清中。研究人员方法的另一个局限性可能是在分离过程中发生一些细胞破裂，随后细胞内内容物泄漏到EF中。虽然这可能在一定程度上发生，但研究人员无法在肌肉EF中检测到几种高丰度的细胞内蛋白（或GFP）。此外，另一项使用类似快速EF分离的研究未能检测到肌肉EF中的细胞内代谢物类别。
图 4 EF 蛋白质组分析可识别产热脂肪组织中许多冷诱导的分泌因子，包括 PSAP
对于较软的组织（例如脂肪组织），考虑此渗漏问题尤为重要。在那里，来自呼吸链的一些细胞内蛋白质以低但显着的水平被检测到。然而，研究人员再次不能排除这些蛋白质是由细胞外囊泡积极分泌的，正如最近描述的那样，或由于分离过程中的细胞泄漏。使用SwissProt亚细胞位置数据库的过滤程序的应用可以在这方面有所帮助，但代价是丢失有关非规范分泌的蛋白质的信息。这在这项研究中已经完成，并允许排除EF中潜在的细胞内非分泌蛋白。
使用这种方法，研究人员已经能够鉴定已知的肌因子，如IL-16，IL-18和decorin（DCN），由于其浓度相对较低，因此很难在血清蛋白质组学中检测到。有趣的是，在肌肉EF中，研究人员还检测到真正的肝因子和脂肪因子，已知它们在运动反应中受到调节，例如FST，血管生成素样4（ANGPTL4），脂联素（ADIPOQ）和抵抗素（RETN）。重要的是，发现了几种可能有助于运动有益作用的新型多肽，例如急性运动肌肉EF中的PLA2G12B，HPN和SORD。在诱变筛查中，PLA2G12B 和 HPN 的功能丧失都与低血清 HDL 水平相关;然而，这些尚未在锻炼的背景下进行研究。值得注意的是，有利的高密度脂蛋白随着运动而增加，并被认为可以降低患心血管疾病的风险。因此，PLA2G12B和HPN是调节运动时HDL增加的潜在候选者。急性运动诱导的另一个有趣的候选者是SORD，一种将山梨糖醇代谢为果糖的酶。最近，SOLD缺乏症与由SURD基因突变引起的缓慢进展的遗传性运动轴索病有关。
SORD缺乏症患者血液中的山梨糖醇水平高出100倍，这表明SORD缺乏驱动山梨糖醇诱导的神经毒性。据研究人员所知，SORD以前从未与运动有关，并且可以作为清除血液中山梨糖醇水平升高的潜在有益因素。NAMPT是MCK-PGC10α小鼠EF中排名前1位的下调蛋白之一。细胞内NAMPT通过影响NAD依赖性酶的活性来调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）池。已在小鼠和人类循环中检测到eNAMPT在急性和慢性炎症（如肥胖和胰岛素抵抗）的情况下升高。
图5 PGC1α诱导PSAP表达和分泌，肌肉和脂肪的冷适应和PSAP表达足以促进原代iWAT脂肪细胞的氧化代谢
然而，这种酶的细胞外调节和功能仍然存在争议。eNAMPT 降低可能是显示 PGC1α 表达升高的生理状况与胰岛素敏感性变化之间的潜在联系。最后，由于PGC1α在肌肉和脂肪组织中带来的代谢益处，研究人员长期以来一直对PGC1α调节的肌因子和脂肪因子感兴趣。在这里，研究人员在冷适应时iWAT的EF和体内MCK-PGC1α小鼠的肌肉EF中鉴定PSAP。全长PSAP是溶酶体蛋白Saposins A-D的前体，在中枢神经系统和外周发挥神经营养功能。值得注意的是，其他神经营养因子，例如脑源性神经营养因子（BDNF），已被证明是通过收缩骨骼肌分泌的，并且在脂肪产热中也起作用。迄今为止，尚未在脂肪组织中研究PSAP表达。如图所示，Psap的强制表达对脂肪细胞的成脂基因程序以及参与氧化磷酸化的基因产生影响。有趣的是，PSAP与溶酶体和线粒体之间的细胞器串扰有关。此外，siRNA介导的敲低小鼠骨髓来源巨噬细胞中的Psap降低了耗氧率（OCR）。
研究人员在这里表明，强制Psap表达足以提高原代iWAT细胞中的OCR。虽然这里尚未探索，但PSAP可能在MCK-PGC1α小鼠中观察到的肌肉神经支配和神经肌肉接头（NMJ）升高中发挥重要作用。事实上，之前的一项研究表明，PSAP在坐骨神经损伤后诱导神经再生;然而，它在肌肉组织中的确切作用仍有待确定。
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