原文题目：TEFM variants impair mitochondrial transcription causing childhood-onset neurological disease
通讯作者：Rita Horvath
隶属单位：剑桥大学临床医学院
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-023-36277-7
线粒体在调节细胞同源淤滞中起着至关重要的作用，因为它们是由氧化磷酸化（OXPHOS）产生的ATP的主要来源，并且它们拥有许多生物合成途径。OXPHOS系统的2个必需亚基在细胞器内合成。线粒体维持和表达编码这些多肽的线粒体DNA（mtDNA），以及全套线粒体（mt-）tRNA和两个mt-rRNA。所有剩余的线粒体蛋白质成分都由核基因组编码，并从细胞质导入线粒体。这包括线粒体转录机制的组成部分，例如线粒体RNA聚合酶（POLRMT），转录起始因子（线粒体转录因子A-TFAM和线粒体转录因子B2-TFB50M）和转录延伸因子（TEFM）。
人类mtDNA的转录在L链（LSP）和H链（HSP）启动子的主要非编码区（NCR）中启动，并产生两个几乎基因组长度的多顺反子前体RNA。LSP 控制 6 个 mt-tRNA 和 ND<> 基因的转录，而 HSP 生成编码剩余蛋白质编码基因、 mt-rRNA和mt-tRNA的转录本。人线粒体中的线粒体转录由DNA依赖性RNA聚合酶POLRMT驱动，其在结构上类似于T3和T7噬菌体中的RNA聚合酶。然而，与噬菌体聚合酶相比，噬菌体聚合酶可以在没有辅助蛋白的情况下识别启动子，POLRMT需要额外的因子。POLRMT与TFAM和TFB2M的关联是转录起始所必需的。TFAM是一种DNA结合蛋白，可将POLRMT募集到启动子中进行转录激活，但也将DNA包装在类核中，而TFB2M的关键功能是修饰POLRMT的结构以诱导启动子熔化。
POLRMT要求TEFM用于伸长阶段。在体外，重组TEFM强烈促进POLRMT合成能力并刺激更长转录本的形成。培养细胞或体内条件Tefm敲除小鼠模型中TEFM的耗竭导致HSP和LSP驱动的启动子 - 远端转录伸长产物急剧减少。最近的数据还表明TEFM参与mtRNA成熟，因为对Tefm敲除小鼠转录组的分析揭示了未处理转录本的积累。线粒体转录和复制在功能上是相关的。LSP 衍生的转录本通常通过在新生 RNA 和 mtDNA 的非模板链之间形成 G-四链体结构，在 mtDNA 主要非编码区 （NCR） 的保守序列块 II （CSB II） 周围过早终止。有人提出，这些过早终止的RNA分子在启动DNA复制中起着关键作用，因为多个RNA到DNA过渡位点聚集在CSB II周围。通过TEFM体外刺激POLRMT合成力可防止G-四链体的形成，从而消除CSB II伸长复合物的进展。因此，有人提出，TEFM抑制过早转录终止的能力作为LSP衍生的主要转录本从复制到转录的转换。然而，体内数据反对该模型，因为TEFM的失活不会导致mtDNA复制起始的上调，并且短LSP衍生的转录本不能用于mtDNA复制。最近的结构研究表明，TEFM通过其C端结构域与POLRMT相互作用。TEFM包含一个假核酸酶核心，该核心在转录POLRMT下游的mtDNA周围形成“滑动钳”。
虽然已经报道了大量的线粒体疾病，这是由于mtDNA复制机制组件的缺陷造成的。线粒体转录成分中的致病变异才刚刚开始出现。最近，POLRMT的变异与线粒体功能障碍和广泛的神经系统表现有关。在一个家庭中发现了TFAM基因的纯合错义变异，导致新生儿出现快速进展性肝衰竭，导致婴儿期死亡。然而，后续研究发现，来自受影响个体的样本中mtDNA拷贝数减少以及线粒体核苷的数量和大小的扰动，这表明该突变影响了mtDNA的维持，这与TFAM在包装mtDNA中的功能一致，除了转录激活外。
在目前的工作中，研究人员报告了来自五个无关家庭的七个个体中鉴定出七个TEFM变体（四个错义，两个移码和一个帧内2-氨基酸缺失），这些个体由于线粒体转录异常而出现线粒体呼吸链缺陷和广泛的婴儿或儿童期发病的神经和神经肌肉症状。
线粒体基因组编码OXPHOS系统的基本亚基和线粒体内翻译所必需的RNA成分，而核基因编码负责mtDNA转录，转录后RNA加工和翻译的蛋白质。近年来，研究人员对人类健康和疾病状态中的这些机器的理解有了迅速的发展。线粒体基因表达功能障碍由线粒体或核基因组突变引起，与以线粒体呼吸受损为特征的多种人类疾病有关。在该组中，在参与mtRNA代谢的核基因中发现了越来越多的突变。
TEFM 变异型患者表现为多种临床表现，包括新生儿乳酸酸中毒、癫痫性脑病、发育迟缓和智力障碍伴脑 MRI 非特异性改变或线粒体肌病伴可治疗的神经肌肉传递缺陷。研究人员队列中的人类TEFM变异都显示出相对较高的残余活性（亚态性等位基因），并且在gnomAD中缺乏纯合LoF变异。杂合子小鼠的杂交没有产生活的纯合基因敲除（Tefm −/−）小鼠，证明Tefm的丧失导致胚胎致死性。然而，P1和P2骨骼肌中极低的残余TEFM蛋白水平与生命相容。与人类TEFM缺乏相关的不同严重程度和表型可能是由于突变酶残余活性的差异，或者可能受到影响线粒体转录和呼吸链活性的其他因素的影响。
图5：TEFM患者的线粒体转录组。
最近在来自七个不相关家庭的八名个体的 POLRMT 基因中发现了常染色体隐性和显性变异。这些患者的临床表现类似于TEFM突变，伴有儿童期整体发育迟缓，肌张力低下，身材矮小，智力障碍，畸形特征和/或癫痫发作，而其他受试者则出现肌肉无力和萎缩或常染色体显性进行性进行性外眼肌麻痹。部分患者脑部MRI显示皮质下白质信号强度高，而其他患者脑室肿大伴胼胝体变薄的白质体积丢失，部分以肌肉受累为主的患者脑部MRI正常。同样，在研究人员的TEFM变异患者队列中，临床和大脑异常是不同的，这表明线粒体转录及其伸长对于广泛的神经元和骨骼肌至关重要。由POLRMT和TEFM突变引起的疾病相似，并且多种特征与其他线粒体疾病重叠，因此线粒体转录伸长缺陷是一种重要的疾病机制。
在研究人员的研究中，一些TEFM患者表现出明显的神经肌肉接头（NMJ）缺陷，对治疗有反应，这对活动能力和生活质量有积极影响。这些患者对沙丁胺醇（一种常用于缓解先天性肌无力综合征（NMJ 原发性疾病）中疲劳肌无力症状的药物）的反应表明 TEFM 参与神经肌肉结构或功能。为了研究这一点，研究人员使用吗啉诺反义寡核苷酸技术生成了TEFM缺乏的斑马鱼模型，以在开发的最初几天敲低TEFM的表达。敲低是马赛克的，允许斑马鱼在发育过程中取得进展，而不会经历严重的、普遍的 RC 活动缺陷。
TEFM表达降低的鱼在1分钟内的移动显着减少，如其他神经肌肉缺陷斑马鱼模型中发现的那样，并且运动的持续时间更长，表明扭曲运动较慢。当斑马鱼从受精后 19 小时 （hpf） 移动到 27 hpf 时，或者如果发育延迟且运动尚未开始，运动会自然减少。然而，研究人员评估了这些鱼的长度和头部角度，以确保它们处于相同的发育时间点，没有发现差异。此外，CRISPR / Cas9 F0 tefm敲除模型也显示出5 dpf的运动缺陷，随着测定时间的流逝，缺陷变得更加明显，这可能反映了NMJ的一些参与。tefm在斑马鱼NMJ发育中的作用的进一步证据是快速和慢速肌肉上突触前和突触后NMJ成分的共存减少以及tefm-MO鱼平均突触前簇大小的减少。由于NMJ具有高浓度的线粒体，并且需要能量来形成，囊泡释放/再循环和突触前细胞骨架的组装，神经肌肉突触很可能极易受到线粒体功能缺陷的影响。或者，TEFM可能在NMJ中发挥作用，而不仅仅是促进线粒体的转录伸长，使其对于适当的突触形成很重要，但是，需要进一步的研究来解决这个问题。在tefm-MO处理的斑马鱼中检测突触前NMJ缺陷支持TEFM变异与NMJ功能障碍之间的联系，并强调改善神经肌肉传递可能会改善TEFM基因中携带双等位基因变异的患者的疲劳性。许多线粒体疾病会影响大脑、神经和肌肉，但线粒体缺陷引起的神经肌肉传递障碍直到最近才被重视。在 80 名患有各种遗传形式的线粒体疾病的患者队列中，包括单纤维肌电图在内的详细临床和神经生理学测试检测到 26% 的神经肌肉传递缺陷。患病率最高的是致病性显性RRM2B变异型患者（50%），但在多种线粒体基因型中发现异常，包括常见的mtDNA变异。NMJ 异常的存在与共存的肌病密切相关，但 15% 的 NMJ 异常患者没有肌病或神经病变的证据。神经肌肉传递的调节剂是否在治疗这些患者中发挥作用尚未得到系统研究。
尽管基因检测和变异致病性预测工具的效用增加，但提供新型变异致病性的证据仍然具有挑战性。因此，体外后续功能研究应作为评估的一个组成部分。研究人员的多方面方法涉及转录组学、定量蛋白质组学、重组TEFM蛋白的活性分析以及对培养患者成纤维细胞中蛋白质稳定性的评估，为P1-4和P6-P7中鉴定的错义和缺失变异提供了令人信服的致病性证据。单个突变不太可能影响TEFM的二聚化，因为已鉴定的突变远离TEFMC末端长α-螺旋形成的二聚体界面。大多数突变聚集在TEFM的重要结构元件 - 接头亚域中，该亚域先前已被确定为对TFEM功能至关重要，并且那里的突变显着影响转录。然而，在P5中发现的错义变异的致病性仍不清楚。由于P5材料的不可用，研究人员无法测试p。（Lys188Arg）和p。（Arg34Trp）对线粒体转录组，蛋白质组或TEFM稳态水平的影响。在P5中发现的两种变体都具有相对较高的群体等位基因频率。虽然p。（Lys188Arg）对重组TEFM活性有明显的不利影响，但研究人员无法研究p。（Arg34Trp）变化对体外转录测定的影响，因为它存在于预测的线粒体靶向序列（MTS）中需要将其去除以允许重组蛋白的高效生产。TEFM中MTS的预测长度为36 aa。线粒体加工肽酶（MPP）识别线粒体前蛋白中的多种MTS，并在-2位置切割单个位点，通常包括精氨酸。因此，Arg34 可能是 MPP 的识别站点。
TEFM中MTS的预测长度为36 aa，Arg34可能是线粒体加工肽酶（MPP）的识别位点，在哺乳动物TEFM中是绝对保守的。MPP 可识别线粒体前蛋白中的多种 MTS，并在 −2 位置切割单个位点，通常包括精氨酸。因此，预计在P34中发现的p。（Arg5Trp）突变将导致线粒体中缺乏TEFM处理和部分展开和部分活性的蛋白质。
源自LSP的转录本在CBSII过早终止，已被建议作为H链mtDNA复制的引物。由于TEFM能够影响CSBII的过早转录终止，因此有人建议将其作为复制和转录之间的切换。根据该模型，CSBII的增强转录终止将产生更多的RNA引物，从而导致更多的mtDNA复制，而减少的CSBII终止事件将导致更高的通读率和转录率（另见“简介”）。TEFM通常刺激转录通过CSBII而不终止。在这里，研究人员发现在P157和P1中鉴定的p。（Pro2Ala）TEFM突变体在CSB II上防止过早终止的能力降低，特别是对于包含较长（G）束序列的模板。此外，研究人员在P1和P2骨骼肌样本中观察到，与对照组相比，mtDNA拷贝数更高。这两个结果可能支持TEFM复制-转录切换模型。然而，在TEFM小鼠敲除中获得的体内数据显示，缺乏TEFM不会导致mtDNA复制起始的上调，而缺乏TEFM会导致从头mtDNA复制的减少。在TEFM敲除小鼠中观察到的mtDNA拷贝数上调归因于线粒体生物发生的代偿性增加，通常发生在严重呼吸链缺陷的组织中。P1和P2骨骼肌样本也表现出呼吸链缺陷。可以触发线粒体生物发生，并为该组织中升高的mtDNA提供另一种解释。另一方面，没有观察到TOMM20蛋白的增加，表明P1和P2骨骼肌的线粒体质量没有改变。需要更多的研究来测试与TEFM相关的复制 - 转录开关模型。
总之，研究人员报告了线粒体转录延伸因子TEFM中致病变异的鉴定和表征，这是来自五个家庭的七名患者的线粒体疾病相关表现的基础。研究人员的体内和体外功能研究将TEFM确定为候选疾病基因，在新生儿或儿童期线粒体脑肌病，疲劳性肌肉无力，癫痫和不同程度的智力残疾患者的遗传诊断检查中应考虑该基因。神经肌肉传递检查可能显示携带致病性 TEFM 变异的疲劳肌无力患者的神经肌肉传递异常，沙丁胺醇治疗可能有益。结合最近关于线粒体RNA聚合酶POLRMT中几种致病变异的报告，研究人员的研究表明，人类线粒体转录机制中的缺陷比以前认为的更为普遍。
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