以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者Nanozymes
背景介绍
纳米酶是一类具有类酶性质的生物激发纳米材料，因其成本低、稳定性高、易于批量生产和催化活性可调等优点而引起了人们的广泛关注。自从阎锡蕴院士等发现氧化铁纳米颗粒（NPs）具有类过氧化物酶的性质以来，各种具有类酶活性的纳米材料已被广泛用于生物传感、组织工程和药物开发等。虽然纳米酶已经取得了重大进展，但相对较低的动力学和催化效率极大地限制了它们的广泛应用。此外，纳米酶的催化活性位点尚不清楚，导致难以深入了解其详细的催化机制。因此，合理设计和开发具有明确活性位点和较高催化活性的多功能纳米酶，仍然是一个重大的挑战。
单原子催化剂（SACs）具有原子分散的金属活性位点，锚定在氮掺杂碳结构（M−N−C）上，由于其独特的电子和几何结构，已成功应用于高效催化剂的制备。单原子纳米酶通过模仿天然金属酶高度进化的催化活性中心，被认为是天然金属酶的潜在替代品，并在许多重要的生化反应中表现出出色的性能。更有趣的是，单原子纳米酶的均相活性位点可以最大限度地提高金属原子的原子利用效率。同时，明确的原子结构和配位环境可以为进一步理解其结构与性能之间的关系提供理想的模型系统。为此，具有多种类酶活性和应用前景的高效单原子纳米酶的研究得到了广泛的关注。
成果简介
受天然酶的金属配位结构的启发，济南大学逯一中教授和北京理工大学梁敏敏教授以及新加坡A*STAR的Shibo Xi教授密切合作，他们发现Co单原子纳米酶的类氧化酶活性在很大程度上取决于Co单原子催化位点周围的局部N配位环境，N原子的配位数可以在很大程度上调节Co原子对O2的吸附性能，从而影响其类酶活性。此外。他们还通过密度泛函理论（DFT）计算和酶活性分析实验证明了所制备的一系列具有不同氮配位数的Co单原子纳米酶（Co-Nx(C)，x = 2,3,4）的N配位与类氧化酶活性之间的调制关系。在所研究的单原子Co催化剂中，具有三配位N原子的Co-N3(C)表现出最佳的氧吸附结构和稳健的活性氧（ROS）生成能力，从而表现出较好的类氧化酶催化活性。这项工作促进了未来在原子水平上靶向反应的合理纳米酶设计的发展。
研究内容
考虑到配位环境是决定Co单原子纳米酶类氧化酶性能的关键参数，首先进行了DFT计算，以筛选出最合适的结构作为高效氧化酶模拟物。在最优吸附构型下，Co-N3(C)模型对O2的化学反应活性最高，被认为是一种很有吸引力的氧化酶模拟物。根据理论计算的预测，通过调节Co/Zn ZIFs在不同热解温度下C-N片段的挥发，制备了不同N配位数的单原子Co催化剂。利用高角度环形暗场扫描透射电镜（HAADF-STEM）对Co-Nx(C)-SAzymes的结构形态进行了表征。为了获得C、N和Co的结合态，进一步进行了x射线光电子能谱（XPS）分析。一对非零价Co的特征峰的存在表明Co-Nx(C)-SAzymes中的钴处于氧化态，Co 2p的结合能逐渐向低方向移动，说明Co-N配位数逐渐减小。
图1 Co-Nx(C)-SAzymes的合成及结构表征。（a）Co-N2(C)、Co-N3(C)、Co-N4(C)的制备工艺示意图及相应的TEM图像。不同配位数的Co-Nx(C)催化剂的元素分布图像（b）Co-N2(C)，（c）Co-N3(C)和（d）Co-N4(C)。（e）Co-N2(C)，（f）Co-N3(C)和（g）Co-N4(C)的像差校正HAADF-STEM图像。
利用X射线吸收近结构（XANES）和扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）测试研究了Co-Nx(C)中Co的局部配位环境和化学状态。Co-Nx(C)的Co K-edge XANES谱的边缘能量介于CoO和Co3O4之间，说明这三种Co单原子催化剂中的Co原子处于Co(Ⅱ)和Co(Ⅲ)之间。此外，随着热解温度的升高，Co-N配位数降低，边缘向低能量方向移动，表明Co中心氧化态还原是温度依赖性的。采用EXAFS拟合分析定量Co-Nx(C)催化剂的配位数，结果表明，Co-N2(C)、Co-N3(C)和Co-N4(C)催化剂中Co-N的配位数分别为2.1、3.2和4.3，验证了所述模型的合理性。上述结果表明所制备的Co-Nx(C)-SAzymes具有原子分散的Co活性位点和明确的配位环境。
图2 Co-Nx(C)-SAzymes的配位环境及原子结构分析。（a）Co-Nx(C)催化剂的XRD谱图。Co-Nx(C)催化剂XPS分析的（b）N 1s谱图和（c）Co 2p谱图。（d）Co k边XANES谱图，（e）FT-EXAFS谱图。R空间Co K边（f）Co-N2(C)，（g）Co-N3(C)，（h）Co-N4(C)的EXAFS拟合曲线。（i）Co-N2(C)，（j）Co-N3(C)和（k）Co-N4(C)的Co K边EXAFS的WT谱图。
以TMB、OPD、ABTS的氧化为典型的催化反应，考察了Co-Nx(C)-SAzymes的类氧化酶活性。Co-Nx(C)-SAzymes的催化活性在N2引入的条件下受到显著抑制，而在O2引入的条件下则显著升高，验证了Co-Nx(C)-SAzymes类氧化酶催化氧化的O2依赖性质。为了进一步量化Co-Nx(C)-SAzymes的催化效率，测试了TMB-Co-Nx(C)反应体系的吸光度、动力学常数和比活度，结果表明，Co-N3(C)具有最优的类氧化酶活性。为了进一步探索Co-Nx(C)类氧化酶活性的反应中间体，通过采用荧光探针、自由基清除实验以及EPR测试测定了催化反应过程中的关键催化中间体。
图3Co-Nx(C)-SAzymes的类氧化酶活性表征。（a）不同反应体系的UV-Vis吸收光谱比较。（b）Co-Nx(C)-SAzymes催化ABTS、OPD和TMB氧化的紫外-可见吸收光谱。（c）Co-Nx(c) -SAzymes在N2、Air和O2存在条件下将无色TMB氧化为蓝色oxTMB的紫外-可见吸收光谱比较。（d）Co-Nx(C)-SAzymes的紫外-可见吸收强度比较。以TMB为底物时Co-Nx(C)-SAzymes的（e）稳态动力学和（f）比活比较。（g）使用荧光探针对苯二甲酸(TA)捕捉催化过程反应体系中产生的•OH的荧光光谱。（h）加入不同自由基清除剂后Co-Nx(C)-TMB体系吸光度的变化。(Ben:对苯醌，Try:色氨酸，Cat:过氧化氢酶)。（i）不同反应体系中Co-Nx(C)-SAzymes的EPR光谱。
为了进一步研究Co-Nx(C)-SAzymes对类氧化酶催化效率的配位作用，采用荧光实验定量表征了•OH的生成速率。由于非荧光香豆素(COU)分子可与•OH反应形成高荧光7-羟基香豆素（7HC）。因此，我们通过测量不同浓度的标准化合物7HC在醋酸缓冲溶液中的光致发光强度，定量了Co-Nx(C)在COU存在下产生的7HC（或•OH）的浓度。结果表明，Co-N3(C)以最快的速率生成•OH。为了探究单原子Co纳米酶类氧化酶催化活性的起源，优化了反应路径，并计算了三种催化剂在最优反应路径上的自由能变化结果表明，Co-N3(C)比其他两种催化剂更容易生成•OH。这与氧化酶样活性的比较结果以及•OH生成速率计算结果一致。由此可见，Co单原子活性位点上O2的吸附和随后的裂解共同对Co-Nx(C)的类氧化酶活性起着决定性作用。
图4Co-Nx(C)-SAzymes的催化反应机理。（a）非荧光香豆素（COU）与羟基自由基（•OH）反应形成高荧光7-羟基香豆素（7HC）。（b）不同反应体系的荧光光谱。（c）不同浓度7-HC的荧光光谱及其（d）456 nm处对应的荧光峰值强度曲线。（e）Co-Nx(C)纳米酶与定量香豆素反应产生的7-HC在456 nm处随时间变化的荧光峰值强度值。（f）Co-Nx(C)纳米酶在不同配位数下生成的•OH随时间的关系。（g）Co-Nx(C)纳米酶产生•OH速率的比较。优化了溶解氧在（h）Co-N2(C)，（i）Co-N3(C)，（j）Co-N4(C)活性位点上的吸附及其在酸性溶液中转化为•OH的反应途径。（k）计算相应反应路径上的自由能变化。
纳米酶作为天然酶的模拟物，因其成本低、稳定性好、耐久性好等优点在生物传感领域得到了广泛应用。通过比较Co-Nx(C)在相同条件下消耗还原性物质以及生物酶的能力来比较Co-Nx(C)的类氧化酶活性。基于Co-Nx(C)-TMB的比色传感系统可以检测这些还原性物质和生物酶，并可以得到待测物质的浓度/活性与吸光度之间的线性关系，进而得到Co-Nx(C)对四种还原性物质和三种生物酶的“消耗量”。通过比较消耗量，Co-N3(C)在每种物质中都具有最高的值，这再次证实了Co-N3(C)具有最佳的类氧化酶活性。此外，这种通过比较“消耗”来比较类酶活性的方法是一种通用策略，可以推广到能够产生还原性物质的其他生物酶。
图5基于Co-Nx(C)-SAzymes的比色分析。（a）通过比较Co-Nx(C)对四种还原性物质（Cys:色氨酸、GSH:谷胱甘肽、AA:抗坏血酸、DA:多巴胺）和三种生物酶（ACP:酸性磷酸酶、ALP:碱性磷酸酶、α-Glu:葡萄糖苷酶）的消耗能力，比较Co-Nx(C)-SAzymes的氧化酶样活性。（b）Co-N2(C)，（c）Co-N3(C)，（d）Co-N4(C)-SAzymes对四种还原性物质和三种生物酶消耗能力的可行性实验。（e）Co-Nx(C)-SAzymes在相同反应条件下消耗四种还原性物质和三种生物酶的能力比较，其中蓝色条代表Co-N2(C)，绿色条代表Co-N3(C)，红色条代表Co-N4(C)。
结论与展望
综上所述，本文报道了N原子的配位数对单原子Co催化剂的类氧化酶催化效率有重要影响。所构建的Co-N3(C)纳米酶在不同配位N数的Co-Nx(C)催化剂中具有最高的催化效率。通过对其催化机制的深入研究，发现氧化酶类活性的结构依赖性归因于Co-Nx活性位点上的氧吸附和解离。由于具有明确的活性位点和明确的配位结构，所开发的Co-Nx(C)纳米酶可成功应用于各种比色分析应用。此外，本文所提出的的概念可以推广到其他单原子纳米酶，这为在原子尺度上微调类酶活性提供了指导思想。
作者简介
李哲，第一作者，济南大学2022届硕士毕业生。主要研究方向为纳米酶的活性调控及其生物分析应用。目前已发表SCI论文13篇，其中以第一作者在Nano Lett.，Nano Res.，Chem. Eng. J.（2篇）, Biosens. Bioelectron. 等杂志发表多篇研究论文。
通讯作者
梁敏敏，北京理工大学教授，博士生导师。主持国家自然科学基金杰出青年基金、优秀青年基金、面上基金、国家重点研发计划等多项课题。在国际重要学术期刊Nat. Nanotech.，Nat. Protoc.，Nat. Catal.，J. Am. Chem. Soc.，PNAS，Nano Lett.，ACS Nano等期刊发表研究论文50多篇，其中8篇入选ESI前1%高被引论文，研究成果入选“中国科学十大进展”。2018年获第三届中源协和生命医学奖。
逯一中，济南大学材料科学与工程学院教授，博士生导师，2015年博士毕业于中科院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室，随后进入新加坡南洋理工大学从事博士后研究。2017年4月以学术带头人身份加入济南大学。获得泰山学者青年专家、山东省优青、吉林省科学技术奖一等奖（第二位）、爱思唯尔中国高被引学者（2020, 2021）等荣誉和奖励。主要从事光/电催化与生物分析领域的研究。以第一作者或通讯作者身份在Chem. Soc. Rev.，J. Am. Chem. Soc.（2篇），Nano Lett.，Adv. Energy Mater.（2篇），Anal. Chem.（5篇）等杂志上发表100余篇SCI论文，总引用次数为6000余次，授权10余项发明专利。
文章信息
相关论文近期以“Regulating the N Coordination Environment of Co Single-Atom Nanozymes for Highly Efficient Oxidase Mimics”为题发表在期刊Nano Letters上。
转自：“NANO学术”微信公众号
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