英文原题：Understanding the Key Roles of pH Buffer in Accelerating Lignin Degradation by Lignin Peroxidase
通讯作者：王斌举，厦门大学；李鹏飞，芝加哥洛约拉大学
作者：Wenhan Fang, Shishi Feng, Zhihui Jiang, Wanzhen Liang, Pengfei Li*, and Binju Wang*
作为参与木质素降解的关键酶，木质素过氧化物酶（LiP）通过两步连续的电子转移（ET）反应介导木质素底物的单电子氧化，随后木质素阳离子自由基通过自发的C-C裂解来实现对木质素的氧化裂解。第一步ET涉及从Trp171到Compound I，而第二步ET涉及从木质素底物到Trp171自由基。尽管LiP酶经过了漫长的实验和理论研究，但其催化机制仍不清楚，尤其是其中的电子转移机制以及pH缓冲液对LiP酶活性的促进根源。实验上发现当改变pH=7至最佳pH=3时，木质素底物的降解率可以提高约10³倍，pH缓冲液是如何加速LiP降解木质素的机理仍不清楚。之前人们普遍认为在pH=3的酸性条件下，蛋白质环境的质子化能够显著增强Cpd I的氧化能力，从而提高LiP酶的催化活性。
图1. 木质素过氧化物酶（LiP）催化过程中涉及的两个长程电子转移。
近日，厦门大学王斌举教授和芝加哥洛约拉大学李鹏飞教授通过深入合作，揭示了LiP酶的催化机制以及pH缓冲液不为人知的作用。在实验中，酒石酸pH缓冲液（酒石酸为二元酸，pKa~3.0，4.3）被广泛应用于LiP的实验。它既可以作为质子供体，也可以作为氢键供体。由于Glu250的预测pKa值为2.94，并且是LiP暴露于表面的唯一可用碱，酒石酸的质子化羧基可能与去质子化的Glu250形成氢键（图1）。该强氢键在QM/MM MD模拟中被证实。首先我们基于QM/MM MD模拟了6种状态下可能的电子转移机理，包括第一步ET(pH=7), 第二步ET(pH=7), 第一步ET(pH=3, without pH buffer), 第二步ET(pH=3, without pH buffer), 第一步ET(pH=3, with pH buffer), 第二步ET(pH=3, with pH buffer)。QM/MM MD模拟表明pH=7和pH=3条件下第一步电子转移都可以自发进行，说明pH对Cpd I的氧化还原能力的影响并不是促进LiP活性的主要因素。我们进一步的内电场计算也支持该结论。有趣的是，第二步ET过程中有没有pH buffer对电子转移过程产生了显著的影响。在pH=3没有pH buffer情况下（即蛋白质质子态是根据pH=3来确定，但是体系不含有pH buffer），Trp171-H•+阳离子自由基进一步向Glu250的转移质子，生成Trp171•中性自由基（图2a）。而在pH=3有pH buffer情况下，酒石酸与Glu250之间的强氢键作用削弱了Glu250的碱性，从而抑制了Trp171-H•+阳离子自由基向Glu250的质子转移。因此，pH buffer可以显著稳定Trp171-H•+阳离子自由基中间体（图2b）。
图2. (a)pH=3没有pH buffer情况下Trp171自由基的存在形式；(b)pH=3有pH buffer情况下Trp171自由基的存在形式。
相比于非绝热Marcus电子转移理论，绝热的QM/MM MD模拟忽略了电子透射系数（<<1），从而极大高估了非绝热ET或PCET反应的速率。因此，我们基于非绝热ET和PCET理论估算了非绝热ET和PCET反应的速率常数。我们可以由表1看出：(1) 对于pH=7和pH=3，第二个ET反应速率都比第一个ET明显要快，这主要是因为第二个ET的电子耦合（~0.02 eV）远高于第一个ET（~0.00024 eV）；(2) pH=3时第一个ET反应速率略有降低，但显著增加了第二个ET反应速率；(3) 对于pH=7的第二个ET反应，计算的ET速率比PCET速率高约4个数量级，因此ET机制比协同的PCET机制更有利。(4) 在pH=3时，计算的ET速率比实验上木质素降解的催化速率高出约2个数量级，而在pH=7时，计算的ET速率比木质素降解的催化速率高出约5个数量级，表明这两个ET过程不太可能是催化循环中的速控步。
表1. 基于Marcus电子转移理论和非绝热PCET理论计算的ET和PCET速率。
最后，我们比较了在pH=7与pH=3时LiP催化降解木质素底物的自由能曲线（图3）。如上所述，由于理论计算的两个ET反应速率相对较快，因而反应的限速步骤将是木质素阳离子自由基的C-C裂解。在pH=7时，C-C裂解的总势垒（同时考虑两个ET步骤和C-C裂解，如图3所示）为19.77 kcal/mol，而在pH=3时，总势垒降低至15.47 kcal/mol。根据过渡态理论，势垒降低~4.3 kcal/mol可使反应速率提高~1480倍，这与实验上观察到的pH从7.39降至3.06可使催化速率提高3个数量级相一致。进一步的理论研究表明，pH=3条件下Trp171-H•+氧化还原电位增加主要源于Asp264的质子化和Glu250与酒石酸之间的氢键。
图 3. pH=7以及pH=3条件下的自由能曲线比较。
综上所述，本文使用QM/MM MD模拟和非绝热ET/PCET理论研究了木质素过氧化物酶降解木质素的pH依赖性。我们的研究发现，酒石酸的pH缓冲液在第二步ET中发挥着关键作用。酒石酸可以与Glu250形成较强的氢键，从而阻止Trp171-H•+阳离子自由基向Glu250的质子转移（PT），进而稳定了Trp171-H•+对木质素的氧化作用。此外，酒石酸的pH缓冲液可通过与Glu250形成氢键及近端Asp264的质子化一同来增强Trp171-H•+的氧化能力。pH缓冲液的这种协同效应促进了第二步ET反应的热力学，并将木质素降解的总势垒降低了约4.3 kcal/mol，使速率提升了约10³倍，与实验结果相符。这些发现不但扩展了我们对生物学和化学中具有pH依赖性的氧化还原反应的理解，而且为色氨酸介导的生物学ET反应提供了有价值的见解。
相关工作近日以“Understanding the Key Roles of pH Buffer in Accelerating Lignin Degradation by Lignin Peroxidase”为题在线发表于JACS Au（https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacsau.2c00649）。厦门大学化学化工学院王斌举教授和芝加哥洛约拉大学李鹏飞教授为论文的共同通讯作者，王斌举教授课题组2019级硕士生房文涵为论文的第一作者，该研究工作得到了国家自然科学基金和芝加哥洛约拉大学启动资金的支持。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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