只需喷一喷！利用纳米载体喷雾实现非转基因的生物工程方法

以下文章来源于植物生物技术Pbj ，作者D.X

传统的作物改良方法（例如转基因工程）是有效的，但获得转基因植物的成本高昂且过程繁琐。叶面喷施生物分子可以提供一种低成本且简易高效的替代方法，以将生物分子引入植物细胞进而改变植物中的基因表达或产生遗传修饰。生物活性分子与纳米载体的结合可以促进它们在叶面施用时通过气孔或表皮途径转移到植物细胞中。

近日，Trends in Plant Science发表了“Nanocarrier spray: a nontransgenic approach for crop engineering”，印墨美越科研人员基于肽的纳米载体，例如细胞穿透肽（cross the cell wall and cell membrane, CPPs）和细胞器靶向肽（transport biomolecules to a particular organelle, OTPs）可有效用于递送DNA、RNA 或蛋白质进入植物细胞的不同区室，并有可能用于生产转基因或基因编辑植物。Thagun等设计了一种基于肽纳米载体的叶面喷洒技术，用于将生物分子输送到拟南芥（Arabidopsis thaliana）和大豆（Glycine max）和番茄（Solanum lycopersicum）。

研究人员将不同的双亲性CPP（BP100）与四甲基罗丹明荧光素（tetramethylrhodamine, TAMRA），然后检测了这些CPP进入大豆和番茄叶片的细胞渗透效率。结果表明，d构型的非聚精氨酸（d-configurated form nonameric arginine, dR9) 由于结合了手性逆转的精氨酸可防止其被细胞肽酶和蛋白酶降解，因此在将生物分子输送到植物细胞方面具有最大的潜力。

进一步将含有花青3（Cy3）标记的pBI221质粒与CPP复合，将这些复合物喷洒在拟南芥、大豆和番茄植物上的结果表明，N末端融合九聚赖氨酸/组氨酸（KH9-BP100）通过叶面喷洒将外源DNA分子转运到植物细胞中最有效。研究人员将带有β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase, GUS）报告基因表达载体pBI221与KH9-BP100（最高效的CPP）形成复合物，以进一步检验基于CPP的叶面施用的功效。将这种复合物的溶液喷洒到拟南芥和大豆叶子上，结果显示在终浓度为 0.05% (v/v) Silwet L-77且pBI221/CPP比率为2.0的5.0% (w/v) 蔗糖溶液在转染的叶子细胞中很容易检测到GUS活性。但pBI221与dR9衍生的CPP的复合物在测试植物细胞的转染效率时，与pBI221/KH9-BP100复合物相比不能显着诱导GUS活性。通过喷雾转染pBI221/KH9-BP100复合物是通过气孔依赖性途径进行的，该复合物在高气孔密度转基因拟南芥(STOMAGEN-OX) 中的转染效率高于低气孔密度(STOMAGEN-amiR)，这表明叶子上存在毛状体可能会减少到达叶面的复合物的活性数量以及它们随后转移到其他植物细胞中的数量。但KH9-BP100 介导的pBI121递送方法的转染效率低于农杆菌介导的拟南芥叶面施用，这可能是由于缺乏pBI121/KH9-BP100 复合物的毒力因子和复制能力以及pBI121在KH9-BP100载体中的低稳定性。

含有siRNA的CPP复合物的叶面喷洒可用于将核酸成功递送至植物细胞以下调靶基因的表达，叶面喷洒 RNAi 构建体 (siGFPS1/KH9-BP100) 会导致黄色荧光蛋白 (yellow fluorescent protein, YFP)标记基因的表达水平急剧下降，表明这种siRNA/CPP复合物可有效诱导植物细胞中的转基因沉默。同样，异位表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)编码基因的转基因番茄叶片喷洒siGFPS1/KH9-BP100复合物显示出比未处理的对照显着降低GFP转录水平和GFP荧光水平。还检查了使用叶绿体靶向肽 (chloroplast-targeting peptide, CTP) KH9-OEP34/CPP BP100 复合物与PpsbA::Rluc荧光素酶报告基因构建体的叶面喷洒将质粒DNA递送到拟南芥叶叶绿体中的潜力。这些发现表明CPP在将核酸生物分子输送到叶绿体中的重要作用。

纳米载体介导的核酸通过叶面喷施靶向递送到植物细胞的图示

这项研究表明，基于肽纳米载体喷雾的递送平台可以有效地用于将生物活性分子递送到植物细胞中，以瞬时表达或沉默几种植物中的靶基因，而不会永久改变植物基因组。该方法可用于植物中的非转基因递送双链RNA以利用植物中的RNAi机制来防御害虫和病毒，以及转座因子等“基因组寄生虫”。然而，与此方法相关的成本可能很高，因为该技术仅诱导瞬时基因表达/沉默。新一代植物将需要再次喷洒纳米载体-核酸复合物。如果这种高通量技术能够稳定地整合基因或允许基因编辑机器的传递产生稳定的基因修饰，它可能有助于克服与组织培养方法相关的生产转基因和基因编辑植物的两个主要缺点，即：植物再生所需的劳力和大量时间和某些植物物种缺乏再生能力。叶面施用的复合物在进入叶细胞后与其他生物分子的生物物理化学相互作用也需要阐明。确定植物物种特异性递送的核酸序列的最佳浓度和长度可能会提高该方法的功效。最后，还应对通过该系统操作中获得的食物进行风险评估。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138522003387

来源：植物生物技术Pbj

转自：“iPlants”微信公众号

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