【Cell子刊】三木大介/朱健康等合作实现水稻中精确和可遗传的基因靶向

基因靶向(GT)是修饰内源性基因组序列的有力工具，如序列替换和基因敲入。尽管在高等植物中GT的效率极低，但工程序列特异性核酸酶(SSNs)介导的双链断裂(DSB)可以提高GT的频率。最近报道了一种CRISPR/Cas9介导的拟南芥遗传性GT的方法，称为“顺贯转化”策略。为了通过序贯转化法高效地建立GT，在携带sgRNA和供体DNA的农杆菌感染的植物细胞中，需要很强的Cas9活性和稳健的DSB。

2023年1月17日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心Daisuke Miki（三木大介）及南方科技大学朱健康等团队合作在Cell Reports Methods 在线发表题为“Precise and heritable gene targeting in rice using a sequential transformation strategy”的研究论文，该研究以玉米泛素1启动子驱动的Cas9为亲本，在粳稻品种中建立了序贯转化介导的GT。该研究实现了对OsFTL1和OsROS1a位点的精确GFP敲入。GT技术将来有望广泛应用于水稻研究和育种应用。

通过工程序列特异性核酸酶(SSNs)进行位点特异性基因组修饰是产生靶向突变的强大工具。近年来，CRISPR/Cas9系统已被广泛用于生成位点特异性双链断裂(DSB)，这些双链断裂可由单引导RNA (sgRNA)以序列特异性的方式识别，用于包括植物在内的许多生物的基因组编辑。生成的DSB通过容易出错的非同源端连接(NHEJ)或无错误同源定向修复(HDR)进行修复(如果提供了精确的修复供体模板)。

通过容易出错的NHEJ途径修复DSB会导致目标位点的随机突变。另一方面，HDR介导的基因靶向(GT)产生精确的基因组修饰，如序列替换和敲入。GT是基因组工程的有力工具，广泛应用于包括果蝇和动物在内的许多生物。然而，由于同源重组的频率极低，GT仍然是一项具有挑战性的任务，特别是在高等植物中。

在高等植物中，GT首次在烟草体细胞叶组织中被报道，后来在水稻中开发了一种基于正-负选择标记的遗传GT方法，但该方法仍然复杂且使用困难。据报道，SSNs可以促进包括人类干细胞在内的许多系统中GT的效率。DSB的引入也增加了植物中同源重组的频率。最近有报道称，在拟南芥和水稻等一些植物中，SSNs成功地介导了HDR介导的GT。大多数报道的GT事件依赖于在目标位点上选择抗生素或除草剂抗性基因的标记，以提高筛选效率。少数报告的事件没有使用选择标记，但GT频率较低。

文章模式图（图源自Cell Reports Methods ）

在高等植物中，大多数GT报告使用了一个一体化系统，该系统包含一个SSN在目标位点生成DSB和一个HDR供体序列。虽然SSNs介导的DSB效率在一体化系统中的独立转化子之间有所不同，但高Cas9活性(反映为DSB效率)在序贯转化方法中得到了保证，从而获得了持续高的GT效率。

已经报道了一种基于DNA连接酶4 (Lig4)突变背景和双病毒复制的水稻序贯转化GT。Lig4是非同源端连接高效修复所必需的，其功能缺失突变增加了HDR频率和不必要的自发突变。此外，双病毒复制子具有有限的宿主范围，并且很难构建病毒载体。该研究证明了序贯转化策略可以用于水稻中GT的建立。该研究的序贯转化策略有望在包括作物在内的高等植物物种中促进转基因。

参考消息：

https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2022.100389

转自：“iPlants”微信公众号

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