PCR / RT-PCR 疑难问题解答

收集了一些关于 PCR / RT-PCR 疑难问题，为大家进行统一解答。

Q1：PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物，怎么处理？

试剂尽量用新的，用自己的，不知道情况的不要用，如果对 RNA 不放心，特别是以前提的 RNA，重新反转，用 RNA 电泳一下看看。

直接用 DNA 电泳的条件电泳 RNA 的，应该没问题，RNA 酶是存在广泛，但还没强到这么短的时间就分解。

Q2：RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物，怎么处理？

Q3：RT-PCR 特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。

可能原因：

1）物和模板非特异性退火

建议解决方法：在第一链合成中使用 GSP，而不是随机引物或 oligo(dT)。试用允许高温 cDNA 合成的 GSP。

2）GSP 设计较差

建议解决方法：遵循用于扩增引物设计的同样原则

3）RNA 中沾染了基因组 DNA

建议解决方法：使用扩增级 DNaseⅠ处理 RNA。使用没有逆转录的对照反应检测 DNA 污染。

Q4：PCR 特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带

Q5：PCR 忠实性：PCR 在产物序列中引入了错误

可能原因：

1）聚合酶忠实性低

建议解决方法：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如 Platinum Pfx DNA 聚合酶。

2）循环数太多

建议解决方法：降低循环数。

3）四种 dNTP 的浓度不同

建议解决方法：制备新的 dNTP 混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物

转自：“生物学霸”微信公众号

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