献给初学者：PCR 引物设计黄金法则和要点

引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应。

引物设计应注意如下要点：

1. 引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。

DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2. 引物长度一般在 15～30 碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是 18～27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。

3. 引物 GC 含量在 40%～60% 之间，Tm 值最好接近 72℃。

GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。

另外，上下游引物的 Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 5℃～10℃。

若按公式 Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 55℃～80℃，其 Tm 值最好接近 72℃ 以使复性条件最佳。

转自：“生物学霸”微信公众号

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