Nature | 噻嗪类利尿剂如何抑制远曲小管回收Na+和Cl- —— 钠氯协同转运体NCC的结构解析

以下文章来源于北京生物结构前沿研究中心 ，作者朱盎岐

高血压影响着全球1/3的成年人，同时也是心血管疾病、肾脏疾病、痴呆的主要危险因素，在全球范围内带来巨大的健康和经济负担【1】。肾脏通过调节体液和电解质的稳态来控制血压，这归功于远曲小管上钠氯协同转运体NCC（sodium–chloride cotransporter），其可以回收Na+和Cl-，进而调节酸碱平衡并控制血压【2】。NCC转运活性下降会引起吉特曼氏综合症 (Gitelman syndrome), 其特征为伴有低钾血症和代谢性碱中毒的低血压【3】；而NCC转运活性上升会引起假性醛固酮减少症，其特征为伴有高钾血症和代谢性酸中毒的高血压【4】。NCC是很多肾脏及心血管疾病的首要药物治疗靶点，包括像噻嗪类利尿剂，其作为第一个具有良好疗效和安全性的口服降压药，仍然是目前首选的一线降压药【5】。尽管应用已久，但是噻嗪类利尿剂选择性抑制NCC的机制目前仍然未知。

2023年2月5日，来自美国斯坦福大学的冯亮课题组在Nature上发表了题为Structure and thiazide inhibition mechanism of the human Na–Cl cotransporter的文章。通过解析人源钠氯协同转运体（NCC）处于两种不同构象及结合噻嗪类利尿剂的结构，提出了NCC转运离子底物及噻嗪类利尿剂抑制转运的分子机制。

作者通过生化实验设计了两个可以高表达的NCC克隆，随后通过冷冻电镜解析了3.0 Å 分辨率的向内开口构象的结构，和2.8 Å 分辨率结合降压药聚噻嗪的向外开口构象的结构。在两个结构中，NCC都呈现为二聚体（图1a和图1b），每一个NCC亚基都由跨膜结构域（TMD）和胞质侧调节结构域组成（NTD和CTD）（图1c）。TMD中的TM1-TM12为APC折叠（图1d）。在胞外侧，一个cap结构域立在由TM1、TM2、TM6和TM7形成的螺旋束上（图1d）。二聚体中的CTD相互交叉并形成稳定二聚体的相互作用界面（图1b）。

图1 人源NCC的整体结构

作者还在CTD处发现了ATP（或ADP）的密度（图2a），将其相互作用的R655和L717突变则会造成转运活性的下降（图2d），说明了腺苷酸的结合对于NCC的功能起到了重要的作用。同时还在CTD的表面观察到了与NTD的相互作用界面（图2b），将其作用界面上的氨基酸做突变，可以观察到NCC的转运活性都存在着不同程度的下降（图2e），提示着NTD-CTD的相互作用对于NCC功能至关重要。NTD中T139的磷酸化对于NCC激活起到了调控作用，在结构中可以发现其位于NTD-CTD交界面中由CTD组成的带正电的区域（图2c），提示其磷酸化可能会调节NTD-CTD的相互作用并介导CTD引起的构象变化。

图2 NCC的调节结构域

作者分析结合聚噻嗪的NCC结构，发现其呈现向外开口的构象，聚噻嗪结合在由TM1、TM3、TM6、TM8和TM10组成的口袋处，并与周围的多个氨基酸相互作用，将其中的N149、F223、N227突变则会使得聚噻嗪抑制效果减弱，这与观察到的结构相吻合（图3）。

图3 聚噻嗪结合区域

在向外开口结合聚噻嗪的NCC结构中，NCC的门腔中途穿过Na+结合位点并在底部到达Cl-结合位点，所以细胞外侧溶液中的离子都可以到达这两个位点（图4a），而在靠近细胞内侧的区域则被堵住（图4b）；在向内开口的NCC结构中，这部分则是开放的（图4c），两个离子都可以从相应的结合位点处到达细胞内侧。向内开口和向外开口的结构比对揭示了各种螺旋的移动机制（图4d），比较聚噻嗪周围的氨基酸，可以发现结合聚噻嗪的NCC如果由向外开口转向向内开口状态，聚噻嗪会和TM10的I532和F536产生位阻（图4e），揭示了聚噻嗪可以阻止NCC从向外开口转变为向内开口状态。另外，聚噻嗪结合区域与Cl-结合位点重叠，所以聚噻嗪也可以直接阻止Cl-结合。综上，聚噻嗪通过与底物离子竞争结合并阻止构象转变从而抑制NCC的功能。

图4 NCC的构象变化及聚噻嗪抑制NCC的机制

综上，本文通过解析NCC处于向内开口及结合聚噻嗪向外开口的结构，解释了噻嗪类利尿剂作用于肾脏远曲小管上钠氯协同转运蛋白NCC靶点的机制，并为优化噻嗪类药物提供了结构生物学的指导意义。同时，NCC结构中其他调节转运的结构域也为下一代药物设计提供了基础。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-023-05718-0

转自：“水木未来资讯”微信公众号

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