从蛋白到结构 | 水木未来成功解析polθ与novobiocin的高分辨冷冻电镜结构

2023年1月21日，水木未来在BioRxiv预印本杂志上在线发表题为“Cryo-EM structure of DNA polymerase θ helicase domain in complex with inhibitor novobiocin”（DNA聚合酶θ螺旋结构域与抑制剂novobiocin复合物的冷冻电镜结构）的研究论文。利用单颗粒冷冻电子显微镜技术，该工作解析了apo状态下DNA聚合酶θ（DNA polymerase θ，Polθ）螺旋结构域以及与抑制剂novobiocin结合的复合物的近原子分辨率结构，揭示了NVB非竞争性地抑制Polθ螺旋酶结构域（Polθ-HLD）的ATP水解的机制。从蛋白表达纯化、冷冻电镜结构解析、活性分析的一体化实验设计和执行全部由水木未来完成。

DNA聚合酶θ（Polθ或POLQ）是具有同源重组（homologous recombination，HR）缺陷的合成致死型靶点，在双链断裂的DNA损伤应答途径中具有重要作用。抑制Polθ的活性与杀死同源重组缺陷的肿瘤细胞有关，在体外和体内都是如此。在这项工作中，通过ADP-Glo assay实验，团队发现抗生素NVB非竞争性地抑制Polθ-HLD的ATP水解。随后，利用冷冻电镜技术，研究者们报告了apo状态下Polθ-HLD的高分辨率的二聚体结构，首次揭示了与抑制剂novobiocin结合的Polθ-HLD结构。

apo状态(左)以及与novobiocin结合(右)的Polθ-HLD冷冻电镜结构

novobiocin可以和很多靶标蛋白结合，包括拓扑异构酶IV(ParE), HSP90,细胞自噬相关蛋白LC3A等，经典的结合方式是novobiocin占据了这些蛋白的ATPase结构域的ATP结合位点。有意思的是，在Polθ-HLD和novobiocin的复合物结构中，研究者们揭示了一个并不与ATP结合位点重合的非经典的novobiocin结合口袋。与同源螺旋酶Hel308-DNA双链复合物的结构比较表明，novobiocin竞争性地与DNA转位途径上的一个三角枢纽结合，阻止ssDNA的结合和转位。

此外，Polθ-HLD的第一个二聚体结构也为揭示微同源末端连接(microhomology-mediated end-joining,MMEJ)机制提供了一个结构框架。Novobiocin抑制剂占位结构与合理的、基于结构的药物设计相结合，无疑将加速发现对人类Polθ具有更好疗效和靶向选择性的强效抑制剂。

转自：“水木未来资讯”微信公众号

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