线粒体 | 北京大学生命科学学院高宁课题组与合作者揭示人源线粒体AAA+蛋白质CLPB发挥解聚酶活性的分子机制

线粒体是一种由双层膜包被的细胞器，负责提供细胞进行各种生命活动所需的能量。线粒体的蛋白质稳态维持对于其功能的正常行使至关重要。AAA+ ATPases（ATPases associated with a variety of cellular activities）在线粒体蛋白质质量控制中发挥着重要的作用。在线粒体内膜上存在两种AAA+ 蛋白酶复合物， m-AAA和i-AAA，它们分别朝向线粒体的基质（Matrix）和膜间隙（Intermembrane space，IMS），负责识别并降解线粒体复合物中错误组装和损坏的亚基，以及一些错误定位的膜蛋白。

线粒体还具有另外一种定位于IMS的AAA+ ATPase—CLPB (Perier et al., 1995)。CLPB基因的突变与人类疾病密切相关，如3-甲基戊烯二酸疾病（3-MGA) (Capo-Chichi et al., 2015; Cupo and Shorter, 2020; Kanabus et al., 2015; Kiykim et al., 2016; Mroz et al., 2020; Saunders et al., 2015; Thevarajan et al., 2020; Wortmann et al., 2015)和重症先天性中性粒细胞减少症（SCN）(Warren et al., 2022)。在急性髓细胞性白血病（AML）中，CLPB蛋白的表达上调还介导了细胞对BCL-2抑制剂Venetoclax的耐药性 (Chen et al., 2019)。尽管CLPB对人类健康很重要，但现阶段对CLPB发挥功能的机制和结构的研究较少，其独特的ANK结构域的分子功能也并不清楚。

2023年2月6日，北京大学生命科学学院高宁课题组与合作者于PLOS Biology在线发表了题为Comprehensive structural characterization of the human AAA+ disaggregase CLPB in the apo- and substrate-bound states reveals a unique mode of action driven by oligomerization的研究论文。该研究利用冷冻电镜技术解析了人源CLPB在apo-和底物结合状态的结构，揭示了其在处理底物过程中的两种不同的寡聚状态。研究发现，CLPB的ANK结构域不仅负责维持CLPB独特高级组装形式，而且对去聚集酶的活性也不可或缺。该研究还通过质谱组学证明ANK直接参与多种线粒体底物的直接相互作用。这些结果揭示了CLPB作为线粒体中通用性的去聚集酶的独特生物物理性质，为以CLPB为靶点的各种线粒体相关疾病的药物研发提供了重要信息。

首先，作者解析了apo状态CLPB的冷冻电镜结构。与经典的AAA+蛋白不同，apo状态的CLPB通过ANK结构域，以“头对头”的方式组装成同源十四聚体（双七聚体）。在apo状态中，中央孔道是空的，整个复合物呈假D7次对称。通过引入突变酶活性中心的突变（E425Q），作者解析了有内源底物结合的CLPB结构。惊奇的是，底物结合状态的CLPB形成了同源十二聚体（双六聚体）。与典型的AAA+ 蛋白质解聚酶或者去聚集酶类似，6个亚基呈螺旋阶梯状排列围绕着底物。AAA+蛋白家族中，七聚体的组织形式非常罕见。为了排除异源表达系统可能引起的假象，作者首先在哺乳动物细胞表达了野生型和突变的CLPB（WT和E425Q），并结合负染电镜分析其组装形式。研究发现，与E. coli表达的蛋白质的多聚形式完全一样：WT CLPB在不结合底物的情况下主要呈现双七聚体的形式；在体外加入模式底物Casein，可以诱导CLPB从双七聚体转变为双六聚体。这表明，双七聚体构象可能是CLPB的静息状态；在底物存在的情况下，底物和CLPB复合物之间的相互作用促进双六聚体的形成，而双六聚体具备更高的ATPase活性，是去聚集酶的活性状态。

由于双七/六聚体复合物分子间和分子内的高度动态性，结构的整体分辨率有限，无法分析底物的具体结合细节。为了探索CLPB结合底物的分子机理，论文解析了单独NBD的电镜结构以及ANK的晶体结构。结构表明CLPB保守的底物结合Loop与底物直接相互作用，围绕着底物呈螺旋阶梯状排列。基于ANK的高分辨结构，作者分析了介导双层结构的ANK结构域的界面，发现界面的某些残基的突变可以显著的降低CLPB的去聚集酶活性。最后，利用LC-MS/MS技术，作者对CLPB ANK结构域的线粒体互作蛋白组进行了定性和定量的分析，揭示了ANK结构域对底物的识别和选择。

综上，本项工作利用冷冻电镜结合生化、质谱等手段，对CLPB的结构和功能进行了系统性的研究，为理解CLPB在线粒体中发挥去聚集酶活性的分子机理提供了重要的理论基础，为后续设计CLPB的抑制剂来治疗相关疾病提供了重要的结构基础。

来源：北京大学生命科学学院

原文链接：

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001987

转自：“威斯腾生命科学研究院”微信公众号

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