导读
溃疡性结肠炎（UC）由于在患者中常反复缓解和复发，并且存在许多严重的并发症（如结肠炎相关癌症(CAC)），导致其发病率和死亡率较高。三七血伤宁（SQ）方剂已用于临床治疗肠道疾病，但其药理学证据有限，有待阐明。在这里，我们阐明了SQ方剂的分子机制。本研究通过网络药理学和加权基因共表达网络分析（WGCNA）预测其在改善UC和CAC方面的治疗价值。我们通过向C57BL/6N小鼠喂食右旋糖酐硫酸钠（DSS）7天来建立实验性结肠炎模型，并使其接受SQ配方处理14天。高通量技术和生化研究证实了抗结肠炎的效果。网络药理学和WGCNA证明，SQ配方的靶点与白介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-1b（IL-1b）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路相关，并与结直肠癌患者的生存率相关。在患有结肠炎的小鼠中，SQ处理以剂量依赖性的方式阻碍了结肠炎的进展，这可以通过恢复结肠长度和体重减轻、改善结肠上皮完整性和消除隐窝丢失来证明。除了抑制血清IL-17、TNFα和IL-1b水平外，SQ方剂处理的结肠炎小鼠结肠缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、PPARα和Caspase3（Casp3）的蛋白丰度降低，PPARγ表达增加。同时高剂量SQ通过增加精氨酸酶1（Arg1）和抑制诱导型一氧化氮合酶2（iNOS2）促进腹腔巨噬细胞的选择性活化，从而促进结肠上皮（NCM460）细胞的迁移并调控肠类器官中TNF诱导的活性氧产生和凋亡。在结肠炎伴生物失调的情况下，SQ方剂逆转了小鼠结肠炎模型中微生物群多样性指数的下降，并恢复了微生物群结构分布。SQ方剂是一种有效的抗结肠炎药物，可促进炎症的解决和恢复肠道菌群稳态。
亮点：
1. 采用网络药理学结合代谢组学分析方法，探讨SQ方剂对实验性结肠炎的治疗作用；
2. SQ方剂通过抑制炎症和挽救肠干细胞凋亡来促进黏膜愈合；
3. SQ方剂恢复了DSS改变的细菌菌群组成，促进了肠道友好代谢物的产生；
4. SQ方剂可预防结肠炎相关癌变的进展。
论文ID
原名：The San-Qi-Xue-Shang-Ning formula protects against ulcerative colitis by restoring the homeostasis of gut immunity and microbiota
译名：三七血伤宁方剂通过恢复肠道免疫和微生物群的稳态来预防溃疡性结肠炎
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2023.01
通讯作者：严静
通讯作者单位：济宁医学院生理学系
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实验结果
1. SQ方剂的治疗作用预测
SQ方剂与5801个结肠炎相关基因共享247个推定靶点（图1A，补充表1）。如京都基因和基因组数据库（KEGG）和基因本体（GO）分析所预测的，它们与细菌来源、氧化应激、脂多糖、感染、结直肠癌和炎症信号通路（包括IL-17和TNF信号通路）的反应相关（图1B）。如饼图所示，三七（PN）占总重量的10.37%，覆盖28%的靶点（图2A）。KEGG和GO分析（图2B）预测了每种草药的富集途径和细胞功能，并证明了PN对外源性和内源性攻击、促炎途径和结直肠癌的调节反应。
表1 三七血伤宁方剂的成分
图1 SQ方剂的成分-靶点网络
（A）显示SQ方剂和溃疡性结肠炎（UC）之间共享基因的维恩图；（B）GO和KEGG基因分析。
图2 SQ改善UC的药理机制
（A）显示靶基因百分比和成分重量的饼图；（B）对方剂中的每种成分进行GO（上）和KEGG（下）分析。
我们从癌症基因组图谱（TCGA）数据库检索了426名结肠癌（COAD）患者的mRNA表达谱和临床信息，并根据SQ -结肠炎基因的表达将患者分为两个集群（图3A）。在通过单变量Cox回归分析（图3B）确定的与COAD患者生存密切相关的25个基因中，通过LASSO回归分析，我们选择了15个基因作为预后标志物（CCL22、SLC4A4、HAR1A、PSCA、WASH7P、IGLV7-43、NOS2、MMP10、EEF1A2、IGKV1D-12、PLIN1、RNU4-1、NDUFB1P1、CHGB、CD177）（图3C和D）（补充表2）。由这些特征建立的预测模型表明，高风险组的生存率低于低风险组（图3E），曲线下面积（AUC）值（分别为0.739、0.736和0.754）（图3F）和明显分布（图3G）证实了该模型的良好判别性能。KEGG分析进一步表明，差异可能归因于TNF和IL-17信号通路和感染（图3H）。
图3 SQ的抗癌作用
（A）KM曲线显示COAD患者集群的预后价值；（B）显示SQ目标危险比的单变量Cox分析；（C – D）LASSO模型建立；（E）高风险组和低风险组之间的生存率；（F）ROC曲线显示LASSO模型的敏感性和特异性；（G）主坐标分析（PCoA）图显示了组群；（H）模型的KEGG分析。
2. SQ方剂的抗结肠炎作用
我们通过超高效液相色谱联合质谱质谱（UPLC-MS/MS）鉴定了SQ方剂的化学特征（补充图1，补充表3）。在我们的体内实验中，DSS处理会损害结肠长度（图4A），不同剂量的SQ方剂可显著逆转。SQ还以剂量依赖的方式改善了结肠炎小鼠体重减轻和疾病活动指数（DAI）评分（图4B和C）。苏木精和伊红（H&E）染色一致显示，SQ抑制了结肠炎诱导的隐窝丢失、上皮水肿和破裂以及免疫细胞浸润（图4D）。与美沙拉秦处理相比，高剂量的SQ具有更显著的抗结肠炎作用，因此我们选择它进行进一步的实验。
图4 SQ方剂抑制实验性结肠炎的进展
（A）结肠组织和结肠长度（n = 8），（B）重量损失（n = 8），（C）DAI评分（n = 8），（D）以及低、中、高剂量SQ处理后结肠炎小鼠的H&E染色和组织学评分（箭头指示受伤部位）（n = 3）。*和#分别表示正常对照组和DSS组的统计学显著差异。
为了证实生物信息学分析的预测，我们通过CytoNCA软件包计算关键基因。基于共享的247个基因和从STRING数据库获取的PPI，我们构建了一个具有富集p值（<1.0 e -16）的网络（左网络）（图5A）。我们根据中位数值检索了20个中枢基因（BC：20.4560319；CC：0.58558586；DC：19；EC：0.118063517；LAC：10.36363636；NC：12.00113585）（右侧网络）。鉴于WGCNA和中枢基因的KEGG分析，我们发现不同剂量的SQ方剂抑制DSS增加了小鼠血清中的TNFα、IL-17和IL-1b水平（图5B）。此外，高剂量SQ降低了HIF1α、Casp3和PPARα的蛋白丰度，并增加了从结肠炎小鼠分离的结肠样品中PPARγ的表达（图5C）。
图5 SQ方剂的关键基因
（A）SQ方剂的关键基因；（B）SQ处理后结肠炎小鼠血清TNFα、IL-17和IL-1b水平（n = 8）；（C）在高剂量SQ处理的结肠炎小鼠的结肠组织中的HIF1α、CASP、PPARγ和PPARα的蛋白丰度（n = 3）。*和#分别表示正常对照组和DSS组的统计学显著差异。
3. SQ抑制炎症和炎症诱导的氧化
为了证实SQ方剂的抗炎作用，我们从结肠炎小鼠中分离出腹膜巨噬细胞（Mφs），并检查其极化状态。高剂量的SQ增加了Arg1，降低了iNOS2的表达，表明腹膜Mφs有利于M2转变（图6A），而来自高剂量SQ处理的结肠炎小鼠的这些腹膜Mφ也促进了NCM460细胞的迁移 （图6B），表明SQ方剂有利于粘膜愈合并促进炎症的解决。
补充图1 液相质谱/质谱（LC-MS/MS）–确定小鼠血清中的SQ成分
考虑到过度的活性氧（ROS）产生伴随炎症并加剧炎症损害上皮完整性，我们培养肠类器官（IOs）并用TNFα处理，以模拟炎症诱导的上皮破坏。TNFα增加ROS水平（图7A）并诱导细胞死亡（图7B），SQ处理的结肠炎小鼠的腹腔Mφs消除了这些改变。
图6 SQ促进巨噬细胞的选择性活化
（A）SQ处理后结肠炎小鼠腹腔巨噬细胞中Arg1和iNOS2的蛋白丰度（n = 3）；（B）伤口愈合实验（n = 5）显示在来自高剂量SQ组的腹腔巨噬细胞的存在下，NCW460细胞迁移情况 ；*和#分别表示正常对照组和DSS组的统计学显著差异。
图7 SQ恢复炎症诱导的肠道类器官细胞死亡
在存在从高剂量SQ处理的结肠炎小鼠中分离的腹腔巨噬细胞的情况下，TNFα处理的肠道类器官的线粒体应激（n = 3）（A）和Hoechst3342/PI染色（n = 3）（B）。*和#分别表示与二甲基亚砜（DMSO）组和TNFα组的统计学显著差异。
4. SQ逆转结肠炎引起的生物失调
营养不良与结肠炎的病因和发病机制密切相关。粪便样本经过16S rRNA测序，获得的操作分类单元（OTU）足以覆盖大多数物种和足够饱和，香农曲线、稀疏度分析和秩-丰度曲线证明了这一点（补充图2 A–C）。如Chao和Ace、Shannon和Simpson指数所示，在高剂量SQ处理后，结肠炎小鼠中微生物群的α-多样性降低被逆转（图8A，补充表4）。PCoA结合非参数多元方差分析（PERMANOVA）和非度量多维标度（NMDS）分析表明，SQ处理改变了β -多样性（图8B和C）。与PERMANOVA的加权unifrac距离表明，SQ促进了阿克曼菌属定植，并抑制了结肠炎小鼠中乳杆菌和大肠杆菌志贺氏菌的丰度（图8D）。为了进一步识别受调控的分类菌群，我们进行了LefSe分析，并证实SQ处理抑制了乳杆菌属和大肠杆菌志贺氏菌的丰度，同时增加了粘蛋白性阿克曼菌（Akkermansia mucinhiphila）（图8E）。通过Mann-Whitney Wilcoxon分析和Picrust2分析计算的BugBase特征预测显示通过SQ处理，潜在致病类菌群的定植减少（补充图2D），影响PPAR信号通路；氨基酸和抗生素生物合成的改进；抑制感染、癌症和过氧化物酶体；调控细胞色素P450（CYPs）活性；进行氨基酸代谢和脂多糖生物合成（补充图2E）。。
图8 SQ处理后结肠炎小鼠微生物群分布的变化
（A）高剂量SQ处理后结肠炎小鼠粪便菌群的α-多样性；（B-C）PCoA和NMDS显示肠道菌群的聚集；（D）使用加权unifrac距离的PERMANOVA以及物种丰度热图；（E）LEFSe说明了细菌种类的丰富性。*和#分别表示正常对照组和DSS组的统计学显著差异。
为了评估代谢谱是否与微生物群的变化一致，我们进行了非靶向代谢组学研究。正常对照和DSS组与Q2Y（0.894，0.782）和R2Y（0.953，0.953）明显聚集（补充图3A），我们通过置换检验证明了模型的有效性（补充图3B）。基于调节的异常代谢物（补充图3C，补充表5），KEGG分析显示结肠炎小鼠中亚油酸代谢受到抑制，CYPs活性增加（补充图3D）。SQ处理改变了结肠炎小鼠中代谢产物的组成（图9A），并分别在正离子和负离子模式下调节了总共736和1599种代谢产物（图9B）。如KEGG分析所示，SQ成功逆转了结肠炎小鼠亚油酸代谢和CYPs活性的变化（图9C），表明与DSS组的代谢谱不同。
补充图2 SQ处理后结肠炎小鼠的微生物群落
秩-丰度曲线（A）、香农曲线（B）、稀疏分析（C）；Bugbase预测微生物群的表型（D），PICRUSt预测SQ处理后改变的途径（E）（每组n = 8）。*** p < 0.001表示与DSS组有显著差异。
图9 SQ处理后结肠炎小鼠的非靶向代谢组学
在正离子和负离子模式下，DSS和SQ处理的结肠炎小鼠之间粪便代谢产物的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）（A）、火山图（B）和KEGG途径（C）。
讨论
我们利用2%DSS建立了小鼠结肠炎模型，以验证SQ方剂的抗结肠炎作用。如我们的体内实验所示，SQ显著减轻了结肠炎小鼠实验性结肠炎的进展和发展，SQ处理后结肠长度的改善、体重减轻和DAI评分的减轻证明了这一点。组织学上，DSS处理导致杯状细胞和隐窝明显丢失、明显水肿和中性粒细胞浸润，所有这些都是UC的特征；然而，SQ方剂成功地逆转了这些病理症状。总之，SQ改善结肠炎作用显著，无明显副作用。为了了解潜在的药理学机制，我们利用网络药理学和WGCNA来预测对抗UC的潜在靶点。通过参考SQ方剂的这些靶点，与这些基因相关的通路类型包括多种关键细胞功能，例如对缺氧、微生物群和ROS的反应，宿主免疫反应（如HIF-1、TNF和IL-17信号通路），以及结直肠癌，表明SQ方剂可能影响了炎症反应和炎症诱导的ROS丰度，并且可调节微生物群落结构。
炎症的持续解决是UC治疗的核心，因为过度的免疫反应会导致屏障破坏，并允许随后的病原体入侵。SQ方剂抑制了结肠中多种促炎症分子（如HIF-1、PPARα和CASP3）的蛋白丰度，并抑制了TNFα、IL-17和IL-1α的血清水平。具体而言，Mφs是一种免疫细胞，当它们转变为M1表型时，可以促进炎症，如果它们极化为M2表型（此表型的Arg1蛋白丰度升高），则可以抑制炎症反应。SQ处理增加了Arg1表达并抑制了iNOS2，表明促进了M2转换。增强的M2转变确保了炎症的持续消退，并有利于粘膜愈合。因此，我们假设SQ方剂具有强大的抗炎作用，其治疗作用由配方中的每种成分实现，包括PN、重楼（PP）、冰片（DG）、山药（DL）、大叶紫珠（CMV）、草乌（AKR）和藜芦（VL）。
补充图3 小鼠结肠炎模型中微生物组分布的变化
OPLS-DA（A）、置换检验（B）和火山图（C）显示了正离子和负离子模式下盐水和结肠炎小鼠之间的代谢物簇；（D）KEGG通路（每组n = 8）。
第二，UC的发生和发展伴随着肠道菌群群落结构的丰富性和多样性的降低。在配方中，DG、PN、PP和DL协同作用，发挥益生元样活性，从而抑制病原微生物的定植。我们发现，SQ方剂恢复了结肠炎小鼠的α-多样性指数，并抑制了变形杆菌、多形拟杆菌、Romboutsia ileails和大肠杆菌志贺氏菌的丰度，所有这些都是生物失调和结肠炎的潜在诊断标志。此外，SQ有利于Dubosiella、Lachonospiraceae NK4A13和黏性蛋白阿克曼氏菌的定植，它们与炎性细胞因子分泌呈负相关，有利于屏障功能和肠道稳态。根据这些发现，非靶向代谢组学表明，SQ处理后，结肠炎小鼠亚油酸代谢受损和CYPs活性增加的情况得到了逆转。值得注意的是，一些CYPs是UC易感性的危险因素。
除了炎症和生物失调外，UC患者还经常发生胃肠道出血，加剧疼痛和精神痛苦。PN和PP作为止血药和止痛剂有着悠久的历史应用，因此，它们的引入可以减轻结肠炎过程中的疼痛和停止直肠出血，这可以通过SQ处理的结肠炎小鼠粪便样本中血清素水平的降低来证实。
最后一个问题是VL和AKR的引入是否会增加毒性。该方剂包含这两种成分，因为它们具有强大的抗炎和抗氧化作用；然而，它通过选择最小剂量的VL和毒性比原材料低的加工AKR来解决这一问题，并进一步选择PN、PP和DG以提供对肝损伤的保护并促进肝再生。
结论
SQ方剂可以抑制结肠炎的发展和进展，其治疗效果是通过抑制炎症反应和恢复肠道菌群的稳态以及止血和镇痛作用来实现的。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36603786/
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