受调节的细胞死亡 (RCD) 是指受特定分子途径控制并可通过遗传或药理学操作进行调节的细胞死亡方式【1】。RCD 不仅在机体发育和细胞稳态中起着关键作用，其失调也与包括癌症在内的多种疾病存在因果关系。逃避细胞死亡被认为是癌症的核心标志之一，许多肿瘤对细胞凋亡诱导疗法的抵抗性激发了人们对探寻其他 RCD 机制的极大兴趣。例如铁死亡，一种由铁依赖的脂质过氧化诱导的 RCD 形式，在形态和机制上与细胞凋亡不同【2】。最近的研究表明，某些对传统疗法耐受的癌细胞特别容易被诱发铁死亡【3】。
由溶质载体家族 7 成员 11（SLC7A11；也称为 xCT）介导的胱氨酸摄入在促进谷胱甘肽生物合成，抑制氧化应激和铁死亡方面具有关键作用。然而矛盾的是，2017年报道发现SLC7A11却在葡萄糖饥饿条件下显著促进细胞死亡【4-6】。2020年美国MD安德森癌症中心甘波谊教授研究组及其合作者在Nature Cell Biology杂志发文（刘晓光博士为第一作者），发现SLC7A11 介导摄入的胱氨酸还原为半胱氨酸过程高度依赖于葡萄糖-戊糖磷酸途径生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)（详见BioArt报道：NCB | 葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡：胱氨酸调控戊糖磷酸途径依赖和二硫化物胁迫）【7】。因此葡萄糖饥饿条件下，SLC7A11高表达细胞内NADPH被大量消耗，胱氨酸等二硫化物异常积累，诱发二硫化物应激 (disulfide stress) 和细胞快速死亡。然而，这是何种细胞死亡类型以及二硫化物应激触发细胞死亡的机制仍然未知。
2023年2月6日，甘波谊教授研究组及其合作者在Nature Cell Biology杂志上发表进一步的研究成果Actin cytoskeleton vulnerability to disulfide stress mediated disulfidptosis（刘晓光博士同为第一作者），揭示了二硫化物应激诱导细胞死亡的机制，并将这种全新细胞死亡方式命名为Disulfidptosis，双硫死亡。
首先，研究者们发现葡萄糖饥饿诱导的SLC7A11高表达癌细胞死亡不属于已知的细胞死亡类型，例如不能被抑制细胞死亡抑制剂恢复（下图），敲除铁死亡关键基因ACSL4或细胞凋亡关键基因BAX/BAK均不能抑制这种细胞死亡。进一步研究发现，SLC7A11高表达一定程度上恢复了葡萄糖饥饿导致的ATP降低。胱氨酸是溶解度最差的常见氨基酸，然而通过电镜观察，研究者们发现这种细胞死亡过程中的胱氨酸累积并没有产生结晶。这些结果表明SLC7A11促进葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡不是由于ATP耗竭或胱氨酸结晶毒性引起的。二硫化物还原试剂抑制，而硫醇氧化试剂Diamide等则显著增强葡萄糖饥饿条件下SLC7A11导致的细胞死亡，因而研究者们将这种细胞死亡命名为Disulfidptosis（双硫死亡）。
图1：二硫化物应激导致的新型细胞死亡类型
为了探究双硫死亡的具体触发机制，研究者们提出假设：葡萄糖饥饿时， SLC7A11高表达的细胞中 NADPH 耗竭和二硫化物应激会诱导某些蛋白上半胱氨酸的巯基之间形成分子间和/或分子内二硫键，进而破坏相应蛋白的活性和功能，造成细胞死亡。研究者们在稳定同位素标记条件下应用生物正交化学蛋白质组学策略来量化SLC7A11高表达的UMRC6肾癌细胞中葡萄糖饥饿诱导的二硫键变化（图2）。结果显示90 个半胱氨酸位点在葡萄糖饥饿时其二硫键至少增加了 1.5 倍。有意思的是，基因本体（GO）分析显示这些二硫键增加最显著的蛋白主要集中在肌动蛋白细胞骨架（actin cytoskeleton）和细胞粘附相关的生物过程或途径。
图2：蛋白质谱组学鉴定双硫死亡中二硫键变化
已知二硫键会影响蛋白质在非还原条件下的电泳迁移率。研究者们发现，UMRC6细胞在葡萄糖饥饿1小时会显著增加 NADP+/NADPH 比率（即NADPH消耗）。在非还原条件下，葡萄糖饥饿2小时后，多种肌动蛋白细胞骨架蛋白出现明显的凝胶迁移阻滞，堆积层附近出现极高分子量条带，表明这些肌动蛋白细胞骨架蛋白在葡萄糖饥饿下形成多个分子间二硫键。而显著的细胞死亡（大于10%）则发生在4小时以后，表明了葡萄糖饥饿诱导的这些肌动蛋白细胞骨架蛋白中的二硫键形成不太可能是细胞死亡的次要后果，而可能是由 NADPH 耗竭引起的。进一步验证发现，2-脱氧葡萄糖2DG（抑制糖酵解但是能进入戊糖磷酸途径生成NADPH）处理确实能防止葡萄糖饥饿诱导的肌动蛋白细胞骨架蛋白二硫键形成及双硫死亡。同时一个有意思的现象是，葡萄糖饥饿导致了明显的氧自由基ROS累积，但是研究者们用ROS清除剂Tempol和Trolox却不能阻止这些异常的二硫键形成，也不能抑制双硫死亡。这些结果表明，葡萄糖饥饿诱导的肌动蛋白细胞骨架蛋白分子间二硫键不是糖酵解受损或ROS累积导致的。研究者们进一步通过免疫沉淀富集细胞内肌动蛋白，发现葡萄糖饥饿导致在堆积层胶附近出现一条明显的蛋白条带，质谱鉴定发现该条带中丰度最高的是actin骨架蛋白MYH9/10和actin本身。由于MYH9/10分子量大于220 kDa而actin只有42 kDa，这暗示actin与这些大分子量蛋白之间形成了多个分子间二硫键交联。遗憾的是，由于技术条件限制，研究者们并没有鉴定到这些含有分子间二硫键的多肽。
接下来研究者们进一步检测双硫死亡过程中肌动蛋白细胞骨架的动态变化。正常培养条件下，肌动蛋白丝（F-actin）主要存在细胞皮层内和组成应力纤维。葡萄糖饥饿引起显著的肌动蛋白丝聚集和细胞收缩。肌动蛋白丝与膜染料的共染色显示葡萄糖饥饿诱导肌动蛋白丝快速收缩，并且在明显的细胞死亡前（4小时）与细胞质膜剥离。
以上的结果表明肌动蛋白丝在双硫死亡中可能具有重要作用。于是研究者们进行了全基因组CRISPR/Cas9筛选，在双硫死亡所需基因（即该基因的敲除会抑制双硫死亡）列表中，SLC7A11 和 SLC3A2（编码 SLC7A11 伴侣蛋白）如预期一样排在第一和第二。有趣的是，排在第四的NCKAP1，编码 Nck 相关蛋白 1，是 WAVE 调节复合物 (WRC) 的一个组成亚基；WRC则 激活 7 亚基肌动蛋白相关蛋白 2/3 (Arp2/3) 复合物以促进肌动蛋白聚合和片状伪足 (lamellipodia) 形成，在细胞质膜下方形成一个分支的肌动蛋白网络皮层【8】。进一步验证发现，NCKAP1敲除确实明显减缓了双硫死亡。进一步研究表明，NCKAP1缺失并不影响SLC7A11和SLC3A2蛋白水平、胱氨酸摄入或NADP+/NADPH比率，但是减弱了葡萄糖饥饿诱导的二硫键形成、 肌动蛋白骨架收缩以及与细胞质膜的脱离。WRC的一个特点是其5个亚基当中任何一个缺失都会导致整个复合物降解【9】。研究发现，敲除WRC其它亚基也会减缓双硫死亡。另外，一般情况下WRC处于抑制状态，其受Rac1 激活以促进细胞片状伪足的形成【10】。进一步研究表明，Rac1 的组成型活性突变体（Rac1 Q61L）的过表达促进细胞片状伪足形成和双硫死亡。总之，这些数据表明 Rac1-WRC 介导的片状伪足形成促进了双硫死亡，这可能是因为片状伪足中的肌动蛋白网络分支为二硫化物应激提供了关键靶点。
研究发现，葡萄糖转运蛋白GLUT1抑制剂BAY-876和GLUT1/3抑制剂KL-11743能够有效抑制细胞的葡萄糖摄入、进而在SLC7A11高表达癌细胞中造成NADP+/NADPH比率增加、肌动蛋白细胞骨架相关蛋白的二硫键交联、骨架收缩和双硫死亡。小鼠体内实验证实GLUT抑制剂能够显著抑制SLC7A11高表达的肿瘤生长并诱导肌动蛋白细胞骨架蛋白的异常二硫键交联。
最后，双硫死亡主要是在SLC7A11高表达的癌细胞中被发现，其主要来源于NADPH供应不能满足胱氨酸还原成半胱氨酸过程，进而造成了二硫化物应激（图3）。研究发现，在无葡萄糖的培养基中添加更多的胱氨酸，也会造成SLC7A11低表达的细胞中NADPH过度消耗、诱导肌动蛋白细胞骨架蛋白二硫键交联和细胞骨架收缩，并最终诱发双硫死亡。
图3：葡萄糖转运蛋白抑制剂诱发肿瘤的双硫死亡
细胞死亡机制的鉴定和表征不仅促进人们对细胞稳态的基本理解，而且还为治疗癌症等多种疾病提供了重要思路。这项研究表明 GLUT 抑制剂诱导的双硫死亡可能是治疗肿瘤的有效策略。当然，目前还有许多问题尚需研究。例如，由于 WRC 的缺失只是部分抑制双硫死亡，表明双硫死亡可能涉及多种蛋白质（包括肌动蛋白细胞骨架蛋白等）中的二硫键异常，因此需要进一步的研究来确定可能在介导双硫死亡中起作用的其他途径。
这是甘波谊教授研究组在Nature Cell Biology杂志发表的课题连续性研究成果，两篇论文中刘晓光博士皆为第一作者。这篇论文是与MD安德森癌症中心实验放射肿瘤中心主任陈俊杰实验室等合作完成，聂立通博士为本文共同第一作者，甘波谊教授和陈俊杰教授为共同通讯作者。甘波谊教授实验室欢迎对细胞死亡和肿瘤代谢及其应用研究感兴趣的博士后、研究生加入。陈俊杰教授实验室欢迎对DNA损伤修复与肿瘤生物学感兴趣的博士后、研究生加入。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41556-023-01091-2
转自：“临床科研与meta分析”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
