背景：
胆管癌(CCA)是一种罕见的恶性肿瘤，可发生在胆管树的任何位置。CCA预后差，临床处理仍具有挑战性，缺乏有效的治疗方法。因此，临床前研究对于加深对CCA的认识和提高治疗效果至关重要。临床前研究涉及开发和管理互补的实验模型，从使用2D或3D培养的原代细胞或细胞系进行的体外检测，到植入材料的体内模型、化学诱导的CCA或基因工程模型。所有这些都是有价值的工具，具有明确定义的优点和局限性。临床前模型的选择取决于待解决的问题。理想情况下，应采用独立的方法总结结果。
简介：
2023年2月8日，来自法国索邦大学的Laura Fouassier教授课题组在Nat Rev Gastroenterol Hepatol（IF: 73.0）杂志上发表题为“Criteria for preclinical models of cholangiocarcinoma: scientific and medical relevance”的文章[1]。在这份共识声明中，一个由来自10个国家的45名CCA分子和细胞生物学专家以及包括病理学家在内的临床医师组成的工作组就临床前模型的最低标准提出了建议，以提供统一的方法。这些建议是基于由35名(第一轮)和45名(第二轮)专家完成的两轮问卷，以就13项声明达成共识。当至少90%的匿名投票参与者同意一项声明时，定义为协议。最终目标是通过增加对疾病的了解，将基础实验室研究转移到临床，并为CCA患者开发临床生物标志物和创新疗法。
主要结果：
体内胆管癌(CCA)模型。
异种移植。异种移植物是将来自不同物种的组织或细胞移植到免疫缺陷宿主体内的移植物。异种移植CCA模型是通过将人肿瘤CCA细胞皮下移植到免疫缺陷小鼠或无胸腺小鼠的侧翼(异位移植)或直接移植到肝脏(原位移植)来建立。这些实验动物模型有助于评估新型候选药物或物理疗法在体内治疗CCA的疗效和安全性。它们具有高度可重复性、成本效益高、技术简便易行、与手术相关的不良反应少、评估周期短等优点。此外，当移植到皮下时，产生的肿瘤在体内模型的整个过程中都很容易获得，这使得可以用卡尺实时测量肿瘤体积的增长。一些研究调查了索拉非尼或表观遗传抑制剂等不同化合物的治疗效果和安全性。此外，通过植入基因操纵的CCA细胞，在异位异种移植模型中评估各种蛋白质和微小RNA的作用。然而，异位异种移植也有其固有的局限性。异种移植物通常反映晚期肿瘤，生长迅速，使早期CCA的研究具有挑战性。
同种异体(同源的)移植。同基因模型可将小鼠CCA细胞植入具有免疫功能的宿主体内，从而显示出功能完整的免疫系统。第一个同基因模型是将两种大鼠CCA细胞系(BDEneu和BDEsp)直接植入Fischer 344大鼠的胆道。虽然BDEsp植入诱导了非转移性iCCA的发展，但BDEsp来源的肿瘤更具侵袭性，CCA病变和转移的形成迅速和一致。该模型被用于阐明肿瘤进展的机制，并评估新型候选药物的疗效。我们利用一种新型同系小鼠模型开发了这种方法，将从胆管结扎(BDL)和基于转座子的CCA模型获得的恶性小鼠细胞系SB1-7移植到小鼠中。获得的细胞系成功植入，形成与人CCA相似的CCA病变。此外，从转基因小鼠胚胎获得的胎肝细胞可以植入小鼠肝脏，诱导CCA形成。此外，我们可以在植入前对CCA细胞进行遗传操作，从而揭示控制胆管癌发生的机制，并使我们能够将细胞植入已经建立的敲除小鼠品系中，从而研究肿瘤间质中特定基因的变化。
化学诱导模型。
肿瘤内的高水平炎症、成纤维细胞活化和丰富的细胞外基质沉积是CCA患者的典型特征。在某些情况下，慢性肝吸虫感染等慢性病患者或原发性硬化性胆管炎患者会发生这些肿瘤，而与这些癌前状态相关的细胞会促进癌症的形成。已经开发出几种产生慢性反复损伤并导致肿瘤形成的化学模型，以重现CCA中的这一复杂微环境。
早期的研究表明，给予大鼠硫脲或硫代乙酰胺(TAA)可诱发2年以上的肝癌形成。TAA是一种强效肝毒素，可通过进行性肝细胞和胆管上皮损伤在啮齿类动物中诱导肝纤维化和肝硬化。TAA引起的胆道损伤重现了典型的不典型增生-癌序列，最终演变为侵袭性iCCA。因此，使用TAA在啮齿类动物中诱导肿瘤起始性损伤已成为CCA研究的基石。然而，正如在这项早期工作中所详细描述的，TAA治疗的大鼠的CCA形成是非常变化的，只有50%的动物发展为明确的癌症。在野生型小鼠中，结果甚至更加多变。TAA本身不具有诱变性;相反，慢性硬化性炎症的启动和持续再生驱动胆管细胞内突变的自发积累，然后发生癌变，正如在慢性胆管病患者中观察到的那样。因此，TAA与经典的梗阻性胆汁淤积及随后的胆管增生模型BDL结合，加速了大鼠胆道肿瘤的形成。
基因工程小鼠模型（GEMMs）。
GEMMs是人类癌症的高级动物模型。它们被合理设计来模拟人类CCA中的遗传和表观遗传改变、信号通路的异常激活以及肿瘤前和早期和晚期肿瘤阶段(包括转移)的顺序。此外，GEMMs可以与体内转染(水动力尾静脉注射和/或电穿孔)或注射(腺相关病毒(AAV))方法耦联，从而在成年肝细胞中激活或表达转基因，从而进一步扩大小鼠模型工具箱。
大多数CCA GEMMs包含在人类中发现的常见致癌改变，包括肿瘤抑制基因(PTEN、SMAD4和P53)的失活或癌基因(KRAS、IDH1/2、AKT1和NOTCH1)的诱导，以研究细胞自主效应对胆管癌发生的后果。在第一个报道的CCA GEMM中，在胚胎发育过程中，使用白蛋白cre (Alb-Cre)菌株对胎儿双潜能肝祖细胞(肝祖细胞(LPCs))的Pten和Smad4进行了消除。Alb-Cre, Smad4flox/flox, Ptenflox/flox小鼠显示了人类疾病中检测到的组织病理学分期，从胆管增生和不典型增生到原位癌和浸润性CCA。
体外CCA模型。
用细胞系或原代细胞进行2D培养。
了解CCA进展和耐药的生物学过程的迫切需要导致了以人类和动物原代培养和已建立的细胞系为代表的体外模型的广泛使用。1985年，第一个CCA细胞系HCholy-Y1从一个iCCA患者中建立并鉴定。后来，从原发肿瘤、腹水、转移瘤和PDXs中产生了一种肝内和肝外来源的CCA细胞系。除了人类的CCA细胞，一些来自小鼠，大鼠和仓鼠模型的细胞系已经被描述。原代培养的正常胆管细胞作为对照细胞。
3D培养再现肿瘤组织。
为了促进个体化或精准医疗，患者资料被用于研究治疗反应。虽然与已建立的CCA细胞系相比，2D CCA模型更接近于患者的体内条件，但3D培养模型(包括球体和类器官)更接近于生理条件。球体是细胞在没有预先定义的培养基质的情况下生长的3D聚集体，而类器官在富含基质的3D环境中自组织并与之相互作用。虽然传统的类器官代表上皮细胞培养，但有一个共识是，理想情况下，3D模型应该升级为包括上皮干细胞、来自肿瘤微环境的细胞(例如，成纤维细胞和/或免疫细胞)和细胞外基质成分，以便分析细胞-细胞和细胞-基质的相互作用。
球状体。肿瘤球通常是由2D生长的贴壁细胞(有时包括基质细胞，如成纤维细胞和内皮细胞)生成的3D多细胞聚合体，用于模拟肿瘤生物学。它们可以在天然和/或合成水凝胶中生长，这些模型的复杂性提高了对肿瘤病理生物学的理解，包括肿瘤稳态和组织。与二维培养不同，肿瘤球固有地再现了肿瘤内发生的氧供应和药物扩散梯度。然而，由于培养条件的复杂性，它们作为高通量、稳健的平台的应用仍然受到限制。
类器官。作者已经建立了从小鼠和人类原代组织外植体或活检样本衍生类胆管器官的稳健方案，并且补充了能够从诱导多能干细胞或从胆汁收集的细胞衍生和增殖类胆管器官的方法。除了来源于健康供体的类器官之外，从肿瘤组织成功建立类器官培养物可大大增加CCA临床前和转化研究的工具箱。该领域的总体共识是，从不同患者肿瘤中建立这些CCA类器官的效率应至少为25%。效率应达到50%以上，才能保证类器官在个体化医疗中的适用性。使用CCA类器官不可避免地存在局限性，包括非恶性胆管细胞类器官的过度生长。使用特定的肿瘤富集培养基，手工挑选非恶性或肿瘤类器官来清除培养物和异种移植是解决这一挑战的方法。
复杂的3D培养系统。
虽然基于水凝胶的细胞外基质用于支持球体和类器官细胞的3D生长，但这通常是小鼠肿瘤来源的基底膜提取物(Matrigel或BME)，不能代表完整的人类或肿瘤细胞外基质。此外，这些培养物通常缺乏额外的基质细胞，如成纤维细胞和免疫细胞。肿瘤微环境通过肿瘤细胞、基质细胞和细胞外基质之间复杂的相互作用，在CCA的发生、发展和侵袭中起着至关重要的作用。靶向这一促结缔组织增生性、富含间质的肿瘤微环境可能对于克服化疗耐药至关重要。因此，将CCA细胞外环境纳入体外模拟肿瘤成分、细胞-细胞和细胞-基质相互作用、形态和肿瘤结构似乎是至关重要的。
图1：胆管癌临床前研究的实验模型组
研究的优势和局限性。
实验模型对于更好地理解癌症发生和肿瘤进展、测试抗肿瘤疗法和破译治疗耐药机制至关重要。CCA的实验模型种类繁多，从简单、实用、廉价到更复杂的类似人类癌症生物学的模型，尽管实施过程更具挑战性，成本更高。模型的选择取决于对它的要求，它的可访问性，最重要的是，它回答一个定义明确的科学问题的能力。2D培养和皮下移植模型是解剖信号通路、确定治疗靶点和研究耐药机制的最常用模型。根据研究类型，体内原位植入模型优于异位CCA模型。如前所述，两者都有优点和局限性。GEMMs虽然复杂且昂贵，但与其他模型相比，似乎更接近于模拟人类肿瘤发生的病理生物学特征。关于体外模型，在更好地再现肿瘤三维结构方面取得了巨大进展。使用这些模型的困难包括建立培养的相对较高的成本和起始材料(人类CCA组织)的可用性。
除了提供CCA科学界目前可用的最精确实验模型的清单(包括评估其优缺点)外，我们还提出了使用这些模型的最低标准建议。通过Delphi法，该领域的专家小组就本文提出的这些标准达成了共识。显然，疾病模型最终应该引导知识从(基础)实验室研究转移到临床，从而更好地理解疾病并提供创新疗法。由于模型的选择高度依赖于研究问题，因此强烈建议使用不同的模型来收集结果，以提供一个全面的肿瘤模拟。这有助于在通过操作离体样本或临床试验对人体进行验证之前，利用明确的最低标准巩固科学数据。
图2：化学模型。在啮齿类动物中启动胆管癌并诱导转移性播散的可用化学模型的示意图总结。
结论和展望：
生物医学研究完全依赖于体内外实验模型，这是基础科学和应用科学研究的先决条件。本共识声明基于一套关于CCA实验模型的建议，以及国际专家组制定和批准的关于这些模型的出版物中应详细说明的信息，以为科学界提供指导。作为补充，专家们简要概述了目前可用的模型，并强调了科学家应注意的优点和缺点。重要的是，本共识声明是基于不同专业(细胞生物学家、分子生物学家、肿瘤科医师、肝病科医师和病理科医师)的研究人员和临床医师的专业知识编写的，因此确保了这些声明和建议对广泛的科学界(从医疗专业人员到直接研究这一致命癌症的科学家)的相关性。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41575-022-00739-y
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