导读
非酒精性脂肪性疾病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等肝病中细胞外小泡(FEVS)和小循环EVS(CEVS)的作用尚未得到证实。在肠道、内皮、枯否细胞和星状细胞中评价EVS的作用。体内实验采用非肌型肌球蛋白轻链激酶(NmMLCK)缺陷小鼠。用16S rDNA基因测序方法分析FEVS的细菌来源。FEVS和小型CEVS由原核和真核来源组成。只有NASH-FEVS有不良影响。NASH-FEVS增加肠道通透性，减少紧密连接蛋白的表达，而nmMLCK抑制、增加内皮细胞通透性以及需要TLR4/脂多糖途径的炎性细胞因子和趋化因子的表达被阻止。NASH-FEVS和NASH-cEV可激活肝星状细胞的促纤维蛋白和促炎蛋白。NAFLD和NASH患者FEVS的细菌来源不同，16个扩增子序列变异差异丰富。我们证明FEVS积极参与导致肝损伤的屏障功能障碍，强调了FEVS携带的nmMLCK和脂多糖的作用。
论文ID
题目：Faeces-derived extracellular vesicles participate in the onset of barrier dysfunction leading to liver diseases
译名：粪便来源的细胞外小泡参与导致肝病的屏障功能障碍的发生
期刊：J Extracell Vesicles
IF：17.337
发表时间：2023.2
通讯作者单位:法国昂格斯大学
DOI号：https://doi.org/10.1002/jev2.12303
主要内容
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)目前被认为是主要的慢性肝病，全球患病率为25%。非酒精性脂肪肝的特点是脂肪变性，导致脂肪毒性。肝脏脂肪毒性先于肝脏炎症，增加了不可逆非酒精性脂肪性肝炎(NASH)出现的易感性。NASH与肝纤维化有关，导致肝脏损伤和疾病加重。在这方面，NASH可能会导致21%到26%的病例发生肝硬化，2.6%和12.8%的病例可能演变为肝细胞癌
在这里，我们提供了从粪便中获得的EV具有原核和真核来源的直接证据，包括肠上皮细胞来源。有趣的是，可以在血液中观察到源自携带内毒素的微生物群的EV。我们强调了NASH患者FEVS导致肠屏障功能障碍与TJ蛋白表达降低相关的严重性。NmMLCK是体内外肠通透性增加的主要靶点。此外，FEVS可能通过作用于TLR4受体的内毒素，增加血管内皮细胞的通透性、单核细胞的移行，以及主动脉和肝窦内皮细胞产生促炎细胞因子和趋化因子。值得注意的是，FEVS和CEV激活了肝星状细胞中促纤维蛋白和促炎蛋白的产生。重要的是，FEV细菌的来源与NAFLD和NASH患者所描述的肠道微生物区系组成是一致的。所有这些效应都突显了FEVS在这些患者中观察到的几个NASH特征中所起的重要作用。
来自非NAFLD/非NASH(Nnnn)捐赠者或NAFLD(NF)/NASH(NS)患者的粪便来源的细胞外小泡(FEVS)的特征
来自Nnnn、NAFLD和NASH患者的FEVS的完整特征表明，这些EV由来源于原核生物、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的EV以及真核细胞组成。对于革兰氏阴性菌，Nash FEVS携带的内毒素较多。关于FEVS的真核起源，我们证明了存在小的囊泡相关蛋白CD81和CD63 Tetraspanins，以及一种特定的肠细胞蛋白GPA-33，一种与肠细胞增殖和迁移有关的蛋白。有趣的是，我们发现来自NASH患者的肠病毒除了携带真核标记外，不仅携带16S rDNA，还携带内毒素，这表明来自微生物群的肠病毒可以通过肠道屏障到达血液，从而参与肝脏疾病的病理生理。
目前的研究揭示了来自Nnnn捐赠者或NAFLD患者的FEVS与来自NASH患者的FEVS之间的一些差异。我们报告了与Nnnnn FEVS相比，NASH FEVS中EVS的数量更少，平均蛋白质含量更低，内毒素浓度更高。我们的元基因组分析突出了NAFLD FEVS和NASH FEVS之间几种ASV的差异丰度。这些差异可能是充分了解肠道-肝轴靶细胞功能差异的关键。值得注意的是，在本研究中，只有NASH患者的FEVS，而不是NAFLD患者，施加了显著的有害影响。
FEVS可能会通过改变的肠道屏障到达血流，并转移到肝脏。NAFLD和NASH中16S rDNA的存在证实了这一点，但在Nnnn cEV中没有。此外，我们观察到NASH患者的FEVS和cEV中的内毒素都比Nnnn捐赠者丰富，这表明FEVS和cEV至少在一定程度上可以解释肝病患者所描述的内毒素血症。由于NASH FEVS灌胃后小鼠的通透性增加仅发生在回肠，而不是空肠和结肠，因此NASH患者的FEVS可能主要作用于回肠，因此含有16S rDNA和内毒素的cEV来自肠道。根据我们的数据，NAFLD/NASH患者的循环内毒素水平较高，内毒素血症标志物与NAFLD严重程度之间存在关联。事实上，Tulkens和他的同事报告说，与肠道屏障受损的患者相比，健康献血者血液中细菌EV的存在较低。在本研究中，Nash FEVS通过减少TJ蛋白、occludin和ZO-1的表达来破坏肠屏障。因此，NASH FEVS可能携带Nnnnn/NAFLD FEVS样本中所没有的毒力因子，从而破坏肠道屏障的稳定，其同源性仍有待确定。
粪源性胞外小泡对肠上皮细胞通透性的影响
接下来，我们讨论了FEVS导致内皮屏障功能障碍和炎症的假说。与NAFLD FEVS相比，携带更多内毒素的NASH FEVS能够增加原代培养的主动脉内皮细胞的内皮通透性和单核细胞的移行。药物阻断TLR4活性可阻止NASH FeV诱导的内皮通透性和单核细胞迁移，提示FEVS激活了TLR4通路。根据目前的研究，我们最近报道了来自代谢综合征患者的富含内毒素的cEV有助于这些患者的低度炎症，并通过激活TLR4来触发内皮功能障碍。在这里，内皮通透性的增加与炎症和细胞因子的产生有关，如IL-6、IL-8、CCL2、G-CSF和GM-CSF。相反，药物阻断TLR4活性可降低NASH FEVS对内皮细胞产生IL-6、IL-8、CCL2和CXCL1的影响。以上结果提示，NASH FEVS携带更多的内毒素，激活TLR4，增加内皮通透性，促进单核细胞迁移，促进内皮细胞产生促炎细胞因子和趋化因子，这与NASH的发生发展相一致。由于HHSECs是第一批遇到FEVS的肝细胞，因此我们对HHSECs的病理生理学相关性进行了评估。事实上，在Nash Fev刺激后，G-CSF的表达增加，这表明它们也可以诱导HHSEC炎症。
最后，进行了元编码分析，以检测NAFLD和NASH患者肠道微生物群落产生的EV的潜在差异。我们没有观察到NAFLD和NASH FEV样本在α多样性和β多样性方面的任何差异。在门水平上，我们观察到NAFLD和NASH FEV样品主要由革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性杆菌和变形杆菌组成。虽然后者在Nash FEVS中出现过多，但在两种样本类型之间没有观察到显著的统计学差异。FEV细菌的来源与NAFLD和NASH患者所描述的肠道微生物区系组成是一致的。事实上，许多研究报告称，与健康对照组相比，NASH患者中的变形杆菌数量增加。此外，NASH FEVS中变形杆菌门的明显过多可能与这些样本中更多的内毒素有关。在Nash FEVS中观察到9个ASV科或属的数量过多。
NASH的FEVS效果和结论
总结
综上所述，我们证明FEVS在屏障功能障碍、炎症和肝损伤中起关键作用，尤其是在NASH患者发病早期。FEV成分反映了细菌来源的存在，这些细菌来源与NAFLD和NASH患者所描述的肠道微生物群组成一致，此外还反映了真核细胞的存在。NASH患者的FEV通过靶向nmMLCK而导致肠屏障功能障碍。FEVS穿过肠道屏障，通过TLR4作用于内毒素，促进全身炎症，促进肝内皮细胞炎症。最后，FEV通过激活星状细胞参与炎症、肝脏损伤以及最终的纤维化。
原文链接
https://doi.org/10.1002/jev2.12303
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