以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者Nanozymes
生物体中多种生物活性分子在维持健康的生理代谢过程中起着重要的作用。研究表明，它们浓度的变化可以反映机体组织、器官甚至细胞的生理和病理状态。目前已经建立了许多针对生物活性分子的电化学检测方法，其中正确设计传感界面是准确和灵敏地检测生物活性分子的关键。纳米酶因其高催化性能、强稳定性和低成本而备受关注。近年来，单原子纳米酶的出现更是将纳米酶技术带到了原子级。通过将先进的单原子技术与酶模拟的固有活性位点相结合，该传感器在催化活性和选择性方面具有独特的优势。
过渡金属和氮掺杂碳材料（M-N-C）的单原子纳米酶因其较大的表面积和强大的仿生酶活性而受到关注。重庆大学生物工程学院侯长军教授课题组基于单原子纳米酶Co-N-C构建了电化学传感器用于多种生物活性分子的检测，相关成果以“Single-atom nanozymes Co-N-C as an electrochemical sensor for detection of bioactive molecules” 发表于Talanta，该工作的第一作者为重庆大学生物工程学院硕士研究生刘奕奕。
作者采用单原子纳米酶构建电化学传感器，用于多种生物活性分子的检测。作者以ZIF-67为前驱体，采用碳化策略成功制备了钴氮共掺杂碳结构（Co-N-C）。并通过简单的水浴复合法，利用还原性氧化石墨烯气凝胶（rGA）的固有特性，成功将单原子纳米酶Co-N-C嵌入rGA中，制备了一种三维层状电极。以Co-Nx作为主要的催化位点，该传感器成功应用于活细胞分泌的过氧化氢和尿液中的多巴胺与尿酸的准确识别。对于过氧化氢，Co-N-C表现出与天然金属蛋白酶相似的过氧化物酶活性和电化学传感性能，在1.9 s内响应迅速，检测限为0.74 μM。并且实现了对活细胞分泌的过氧化氢的灵敏和特异性检测。另一方面由于rGA独特的三维层状结构，该传感器具有较强的电催化性能，实现了多巴胺与尿酸的同时检测，准确捕获尿液中的多巴胺与尿酸信号。
图1 基于单原子纳米酶Co-N-C的电化学传感器，用于生物活性分子检测
利用rGA优异的导电性和大比表面积的特性，在其三维层状结构上负载纳米酶Co-N-C，用于增强Co-N-C的电催化性能。通过SEM图像可以清晰看见rGA层状薄片结构和清晰的多孔结构，并具有良好的孔隙率，可以提供更多的活性位点，以促进反应过程中的电子转移。STEM图像显示了小焦距下Co-N-C的形态。由于热解过程，Co-N-C产生具有大比表面积的石墨碳。这种结构通常伴随着大量的纳米孔用于锚定单个钴原子。利用暗场HAADF-STEM进一步证明钴原子活性位点的存在。
图2 Co–N–C/rGA的表征
（a）rGA的SEM图像（b）Co–N–C/rGA的SEM图像（c-e）Co–N–C 的TEM，STEM，HAADF-STEM与EDS图像
图3是对Co–N–C过氧化物酶活性的评估。由于M-N-C纳米酶具有金属卟啉样结构，作者推测Co-N-C可能与天然辣根过氧化物酶（HRP）具有类似的催化机制。通过TMB的经典显色反应，验证了其过氧化物酶的活性。与预期一样，Co-N-C催化TMB氧化为oxTMB，在652 nm处有可见的颜色变化。相比之下，单个TMB、过氧化氢和TMB/过氧化氢体系不能产生着色反应。同时，对10-100mM过氧化氢浓度和1-10mM TMB浓度变化的紫外吸收光谱分析表明，在较低浓度的过氧化氢和TMB，Co-N-C仍然可以催化颜色反应，在652nm处产生峰值这些结果表明，Co-N-C具有较强的过氧化物酶活性。
图3 Co–N–C过氧化物酶活性验证（a）Co–N–C催化TMB显色反应（b）10-100mM过氧化氢浓度变化（c）1-10mM TMB浓度
作者选择人乳腺癌细胞MCF-7，用Co-N–C/rGA@GCE传感器检测活细胞分泌的过氧化氢。从图4可以看出，当加入PMA刺激细胞产生过氧化氢时，发生明显的电流响应，并快速达到最大电流响应，约为2.10μA。结果表明，PMA刺激细胞产生过氧化氢，它被传感器成功捕获并将生物信号转换为电流信号。因此，Co–N–C/rGA@GCE传感器成功地用于测定 MCF-7活细胞释放的过氧化氢，并具有应用于病理生理检测的潜力。
图4 MCF-7细胞分泌过氧化氢的实时检测
图5展现了当不同浓度的多巴胺和尿酸同时加入检测体系时，浓度的增加与电流响应具有良好的线性关系。并且多巴胺和尿酸的氧化峰可以很好地区分。多巴胺和尿酸的检测范围分别为2–45 μM和5–300 μM，检测限分别为0.53 μM和19.38 μM。上述实验结果表明，Co-N-C/rGA@GCE可用于多巴胺和尿酸的同时电化学检测。并且成功实现了尿液中多巴胺和尿酸信号的捕获（图6）。
图5 多巴胺和尿酸的（a）同时检测以及（b，c）线性关系
图6 尿液中的多巴胺和尿酸的同时检测，稀释（a）5倍和（b）5-10倍
总结与展望
作者通过简单的方法成功制备了具有优异过氧化物酶活性的单原子纳米酶Co-N-C，并将其应用于生物活性分子检测。它具有原子分散的Co-Nx催化位点，因此它们显示出类似于天然酶的催化活性。利用新兴的单原子技术结合rGA的优异性能，增强了Co-N-C/rGA复合材料的电化学响应，实现了对生物活性小分子的快速灵敏检测。Co-N-C/rGA@GCE已成功应用于活细胞中释放过氧化氢的检测，拓宽了单原子纳米酶在活细胞生物传感中的应用。同时，Co-N-C/rGA@GCE成功地实现了UA和DA的同时检测，表现出令人满意的重复性和稳定性。并且实现了尿液中多巴胺和尿酸信号的同时捕获。这项工作拓宽了单原子纳米酶在电化学传感领域的应用，为未来疾病的早期诊断提供了新的方法。
该项成果发表在Talanta上，第一作者为重庆大学生物工程学院的硕士研究生刘奕奕，重庆大学生物工程学院的霍丹群教授和侯长军教授为通讯作者。
转自：“NANO学术”微信公众号
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