以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者Nanozymes
纳米酶在比色传感领域有着广泛应用，作为信号转换输出材料(signal-reporting material, SRM)，其对比色传感检测性能具有重要影响。因而，发展高催化活性纳米酶用于SRM不仅在比色生物传感应用中起到信号转化作用，而且兼具信号放大功能。换言之，制备出色催化活性的SRM是构建高灵敏度比色传感平台的先决条件。目前，纳米酶的活性调控主要集中于粒径大小调节、形态/形状改善、改变组成以及形成复合/杂化材料等。在天然酶催化过程中，不仅催化活性中心发挥决定性作用，活性中心周围微环境同样对催化起到重要辅助作用。由于纳米酶的催化反应发生在纳米颗粒表面，同理，改善其表面催化微环境对调控纳米酶的催化活性同样具有积极意义。此外，在优化纳米酶材料本身特性实现活性调控同时，亦需探寻通过外源性刺激改变反应条件实现纳米酶活性增强。
基于上述分析，广西师范大学叶芳贵教授课题组报道了一种L-肌肽(L-Car)表面功能化修饰的纳米二氧化铈磷酸模拟酶(L-carnosine-modified nanoceria phosphatase-mimicking nanozyme, CMNC)的设计合成，该纳米酶通过在二氧化铈纳米颗粒表面引入末端含咪唑氨基酸残基来模拟天然磷酸酶的反应微环境以提高脱磷酸催化活性（图1）。同时，利用超声辅助进一步促进CMNC磷酸酶催化活性的提升，实现CMNC从材料表面结构优化和特定外部刺激双重作用增强其催化活性。并利用纳米酶双重催化增强作用实现双重信号放大高灵敏度比色传感器构建。
图1. (a)碱性磷酸酶的结构和活性位点微环境，(b)本工作所构建磷酸纳米酶及其表面官能团微结构
作者首先选用L-Car、L-精氨酸(L-Arg)和硝酸铈作为合成前驱体，在室温条件下通过一锅法直接实现CMNC的简便合成与L-Car表面修饰。实验过程中，前驱体溶液经5 min反应后，溶液颜色由无色逐渐变为浅棕色、深棕色、最终呈现金属光泽淡黄色。期间，当L-Arg和L-Car加入Ce3+溶液后，由于L-Ca和L-Arg存在丰富的官能团，能够与Ce3+发生络合并立即形成Ce-Arg, Ce-Car和Car-Ce-Arg等络合物。一方面，L-Arg中胍基的水解产生大量的碱性OH-离子，促进大量Ce-O(如Ce(OH)3)簇合物的形成。另一方面，成核过程中溶液存在的溶解氧溶液及NO3-离子部分氧化Ce3+离子形成氧化态的Ce4+离子，最终促使CMNC的形成(图2)。随后通过系列表征技术对CMNC的结构特性、表面官能团等进行了分析确认。值得注意的是CMNC纳米颗粒的形成主要遵循先形成离散型核簇再生长成纳米颗粒的生长方式（而非连续纳米颗粒生长式）。
图2. (a) CMNC合成示意图，(b)低倍TEM图(内插图为120个粒子统计分布图)，(c, d) 高倍TEM图，(e)原子级分辨率HAADF-STEM图，(f) SAED图
其次，作者测试了CMNC纳米酶的类磷酸酶活性，通过米氏常数(Km)、酶促反应的最大速率(Vmax)和活化能(Ea)等参数考察L-Ca引入对二氧化铈的磷酸酶催化活性影响。考察了L-Car不同合成用量对所得CMNC纳米酶的类磷酸酶活性影响。同时，在合成过程中利用分子结构相似的其它含咪唑功能分子（如L-组氨酸、3-(咪唑-4-基)丙酸和4-咪唑乙酸等）代替L-Car合成二氧化铈，分析对比其催化性能，最终确认末端含咪唑环功能分子引入二氧化铈表面可以改善其催化微环境，有利于增强其类磷酸酶催化活性。初步推断L-Car修饰产生的活性增强可能来源于以下两方面：一方面，L-Car分子的引入在促进脱磷酸化水解过程中质子转移的同时，通过氢键增强了CMNC与磷酸酯底物之间的亲和力。这个质子转移传递过程最初由L-Car的咪唑基团启动，可以随时提供和回收质子。另一方面，L-Car的咪唑基团作为亲电/静电激活剂，即L-Car分子降低了与铈离子结合的H2O的pKa，从而产生更多的亲核物种(如可用的OH-离子)，促进磷酸酯水解过程中重要的亲核攻击反应，从而提高磷酸酯键水解效率、增强催化脱磷酸化反应。
再次，本文探究并证实了超声刺激对CMNC磷酸酶催化活性的增强作用。针对超声增强CMNC磷酸纳米酶催化活性现象，初步提出了基于超声空泡效应的脱磷酸化反应增强机制。CMNC纳米颗粒作为声敏剂通过降低空化阈值为反应溶液中空化气泡的形成提供了大量的成核位点。相应地，空化气泡破裂时会在气泡-溶液-粒子三相界面处产生极高压力(可高达108 Pa)，进而使得三相界面具有物理和化学双重效应，为CMNC磷酸纳米酶活性增强提供了良好的前提条件。此外，除了在气泡-溶液-颗粒三相界面区域产生高温、压力和可能的电场梯度， 超声还可以改善磷酸酯底物分子和CMNC纳米颗粒之间的质量传递，使得更多的底物分子有机会与活性位点接触。且超声引起的局部加热效应使得为吸热反应的脱磷酸作用更有利于水解进行。同时，超声空化也促进了CMNC纳米颗粒表面氧缺陷位点的形成，其反过来又为脱磷酸化反应提供了潜在的催化活性位点。此外，超声空化引起的气泡-液-颗粒三相界面促进ROS的生成，从而促进 CMNC纳米颗粒的表面羟基化，进一步增强CMNC脱磷酸活性(图3)。
图3. 超声辅助增强 CMNC 脱磷酸水解潜在机理示意图
最后，在确认了CMNC优异的类磷酸酶活性和超声辅助催化活性增强特性后，将CMNC纳米颗粒应用于典型生物标志物C-反应蛋白(CRP)的双重信号放大超灵敏免疫分析比色传感。结果表明，由于CMNC/超声辅助体系的高催化活性性能，基于L-Car的表面修饰和超声辅助可以显著提高二氧化铈磷酸纳米酶的检测灵敏度。与之相比，利用未经修饰的CeO2或CMNC无超声辅助体系构建CRP比色传感的LOD分别为53.2和5.8 ng/mL，分别比CMNC/超声分析检测体系对应值高53和6倍(图4)。
图4. 超声辅助CMNC、单纯CMNC及普通二氧化铈构建CRP比色传感检测。(a) CRP的ELISA比色传感检测示意图，(b)超声辅助CMNC、单纯CMNC及普通二氧化铈检测不同浓度 CRP 显色照片(其中×1, ×4 及×12 分别表示底部系列浓度的倍数)，(c, d) 超声辅助CMNC、单纯 CMNC 及普通二氧化铈构建ELISA 比色传感检测 CRP 的系列浓度吸光值及标准曲线图
综上，本项工作通过利用含末端咪唑官能团的L-Car进行表面修饰，设计并构建了表面官能化的二氧化铈磷酸纳米酶。结果表明，L-Car的引入可以显著提高二氧化铈磷酸纳米酶催化活性。此外，研究发现超声辐射可以进一步增强 CMNC 的类磷酸酶催化活性。因此，基于表面修饰的界面化学和超声激活的机械化学双重作用，构建了超灵敏的纳米酶比色免疫分析传感平台。一方面，超声增强磷酸纳米酶可以为检测应用提供一种潜在的比色信号放大策略。另一方面，纳米粒子表面末端咪唑环氨基酸残基引入策略为理性设计及合成磷酸纳米酶提供了新思路。
该工作以“Dipeptide Surface Modification and Ultrasound Boosted Phosphatase-Like Activity of the Ceria Nanozyme: Dual Signal Enhancement for Colorimetric Sensors”为题发表于ACS Sustainable Chemistry & Engineering。
转自：“NANO学术”微信公众号
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