合成生物学新进展！基于水稻稳定遗传转化在种子中高效表达SARS-CoV-2受体结合域蛋白

在41种已获批准的COVID-19疫苗和目前正在进行临床测试的约220种候选疫苗中，大多数都是围绕SARS-CoV-2刺突(S)蛋白或其中的受体结合结构域(RBD)设计的，该结构域通过与细胞表面的血管紧张素转换酶2 (ACE2)结合来促进病毒的摄取。S蛋白/RBD也被用作抗体检测和抗体滴度量化诊断试剂盒的组成部分。目前，植物被评估为COVID-19疫苗和诊断试剂的大规模生产平台，因为它们比发酵罐平台更具成本效益，因此特别适合低收入和中等收入国家。瞬时表达具有快速和可扩展性的优势，已被用于生产COVID-19试剂和一种已获批准的疫苗。然而，转基因水稻为长期大规模生产提供了稳定的资源，并且已经被用于生产抗病毒抗体和凝集素。

近日，在国际学术期刊《Plant Biotechnology Journal》上在线发表了题为“Production of the SARS-CoV-2 receptor-binding domain in stably-transformed rice plants for developing country applications”的研究论文。作者通过构建载体转化水稻愈伤组织，其中RBD基因在组成型玉米ubiquitin启动子和第一内含子(Ubi-1)或胚乳特异性大麦D-大麦醇溶蛋白启动子(Hord)的控制下表达，每个启动子都含有靶向分泌途径的水稻α-淀粉酶信号肽。作者共获得了31株pUbi-RBD转基因愈伤系和34株pHord-RBD转基因愈伤系。采用ELISA法测定RBD的含量，以人ACE2作为捕获试剂，以确保只检测到正确折叠且可溶的RBD形式。约87%的pUbi-RBD愈伤组织系存在功能性RBD, 约82%在western blot检测到的水平上积累了正确折叠的RBD。RBD的最高产量为6.88±1.28µg g-1鲜愈伤组织重(fw)。然而，pHord-RBD转化后只有~15%的株系产生了有功能的RBD蛋白，只有5个株系达到了western blot检测的水平。pHord-RBD愈伤组织中RBD的最高产量为2.20±0.9µg g-1 fw，比表现最好的pui -RBD株系低3.12倍(图1a)。

作者通过再生获得了15株含pUbi-RBD的独立T0转基因水稻和14株含pHord-RBD的独立T0转基因水稻。将具有代表性的T1种子提取物采用ELISA检测。在株系19中，pui -RBD种子中可溶性和正确折叠的RBD的最大数量为5.31±0.50 μg g-1 dw，而在株系8中，pHord-RBD种子提取物中的最大数量为0.66±0.08 μg g-1 dw(图1a)。作者还对株系9、19、26的根提取物进行了分析，第19系的最高产量为5.25±0.90µg g-1 fw。RBD在株系9的旗叶(3.11±0.33 μg g-1 fw)和株系19的旗叶(4.44±1.01 μg g-1 fw)中均有积累，26号植物种皮中也均有积累，9号植物种皮中积累量最高(3.54±0.44 μg-1 fw)。

最后，作者评估了来自所有6个系的种子来源的RBD结合ACE2的能力，确认了所有情况下的特异性和浓度依赖性结合(图1b)。这些结果证实了RBD的结构完整性，并表明水稻种子适合于开发可扩展的生产平台。

据悉，这是首次在转基因植物中表达SARS-CoV-2 S蛋白的重要组分。一些研究者在烟草叶片中通过瞬时表达产生RBD，其产量范围为2-4µg g-1叶fw，覆盖残基319-541到117±41µg g-1叶fw(截断结构(残基319-533)，其中在538位缺乏半胱氨酸残基。产量根据RBD序列的长度、其他结构物的存在、基因转化方法、半胱氨酸残基的数量和亚细胞靶向策略而变化。第19系(pUbi-RBD)愈伤组织的最大产量为6.88±1.28µg g-1 fw，第9系(pUbi-RBD)叶片的最大产量为4.05±0.67µg g-1 fw，这与之前在烟草叶片中表达相同RBD变体(残基319-541)的研究结果相比有所改善。这两个株系的结合活性均以愈伤组织最强，种皮和根次之。但依据产量足以证实可以将种子开发为中低收入国家的生产和储存平台。假设生物量产量为10吨/公顷，目前产量约为5毫克/公斤dw，相当于50克/公顷，假设回收率为70%，这将足以提供1400剂25微克/剂的疫苗。通过结构优化和育种，将产量提高10倍至50 mg/kg，产量约为500 g/ha，在相同的回收效率下，相当于14,000剂疫苗。

总之，在稳定转化的水稻植株中，作者在包括种子在内的一系列组织中表达了SARS-CoV-2 RBD，评估了RBD的组成型表达和种子特异性表达，发现前者在所有组织中产量最高，包括愈伤组织和种子(其中胚乳特异性启动子也很活跃)。最后，推进这一概念验证的下一步方法是用可切割的纯化标签表达蛋白质，以简化蛋白质分离，允许纯化的天然蛋白质被释放用于功能评估。基于作者使用每种结构获得的最大产量，最后得出结论，组成型启动子在愈伤组织中的活性提高了三倍，在种子中的活性提高40倍，在这种情况下，种子中的RBD产量仍然足以在中低收入国家中开发生产平台。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.14023

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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