以下文章来源于CellPress细胞科学 ，作者Cell Press
医学
Medicine
近日，来自日本京都大学iPS细胞研究与应用中心（CiRA）和CiRA基金会的科学家们报告了一个临床级iPSC“单倍体库”。2022年11月16日，该研究论文以“A clinical-grade HLA haplobank of human induced pluripotent stem cells matching approximately 40% of the Japanese population”为题发表在Cell Press细胞出版社旗下医学旗舰期刊Med上。
重要性
人类诱导多能干细胞（iPSCs）可以分化成多种细胞，有可能以再生医学的方式为许多疾病带来治疗。在这里，来自日本京都大学iPS细胞研究与应用中心（CiRA）和CiRA基金会的科学家们报告了一个临床级iPSC“单倍体库”，该库可覆盖40%的日本人口，且几乎没有排异风险。这些iPSC系已经被用于10余个临床试验中。
简介
诱导多能干细胞（iPSCs）由体细胞（如血液和皮肤中的细胞）通过细胞因子介导的重编程产生，并表现出自我更新和多能的特性。2006年小鼠iPSCs的产生首次得到报道，次年人类iPSCs的产生得到报道。此外，iPSCs已被用于阐明疾病机制、药物发现和个性化医疗。2014年9月，iPSC衍生的视网膜色素上皮细胞在一名老年性黄斑变性患者身上进行了首次人体移植，目前已有十余项临床研究和试验开始并正在进行。
基于iPSC的移植医学的一个优点是通过自体移植可以避免免疫排异。然而，鉴于自体移植所涉及的时间和费用，准备临床级别的iPSCs用于异体移植是目前另一个可行的选择。在异体移植中，一个关键问题是减少免疫排异反应。一个有吸引力的方法是储存来自在HLA-A、HLA-B和HLA-DR这三个等位基因上纯合的供体的iPSCs，这三个基因是免疫排异最重要的决定因素。日本人口的特点是HLA单倍型的多样性很低；大约50%和90%的日本人口可以由10个和140个HLA纯合的捐赠者覆盖。
本文在此报告建立了一个HLA纯合子iPSCs单倍体库，理论上覆盖了约40%的日本人口。文章描述了供体招募、细胞制造和开发临床级iPSC系所必需的质量控制（QC）过程。文中提到的的iPSC系已被用于多项临床试验，并为基于iPSC的细胞疗法提供了关键的见解。本文还讨论了用于临床目的的iPSCs的制造和质控方面的未来前景。
结果
本研究的整体工作流程见图1。建立单核细胞库的关键步骤包括招募供体、生成临床级iPSC和质控。表1总结了iPSC生成和质控测试的结果。每个捐赠者的性别和血型也得到记录，因为这些因素可能影响移植细胞的移植成功率。
捐献者招募
自2013年以来，研究组与日本红十字会、日本骨髓捐赠计划和脐带血库合作，招募HLA纯合的捐赠者，这些机构拥有大量的HLA单倍型数据库。为了确保捐赠者的隐私和自愿参与，我们从这些组织中确定了HLA纯合捐赠者，并向他们发出信函，请求他们参与iPSC单倍体项目。那些对这项研究感兴趣的人按照自己的意愿直接联系了我们的研究协调员。在获得参与者的知情同意后，研究者向血小板和骨髓捐赠者收集了外周血样本。对于来自脐带血库的参与者，研究收集了冷冻样本。捐赠者的身份是匿名的，并提供了一个四字母的识别（ID）号码（例如，QHJI和RWMH）。
2021年底，研究组从日本红十字会的血小板无偿捐献者中招募了8名HLA纯合捐献者，从日本骨髓捐献者计划中招募了32名捐献者，从脐带血银行招募了7名捐献者。这47位HLA纯合的捐赠者涵盖了28种不同的HLA类型，并提供了HLA匹配的iPSCs，覆盖了大约60%的日本人口。研究组从七个供体中产生了iPSC系，涵盖了日本人口中最常见的四种HLA单倍型。这些已建立的iPSC系为大约40%的日本人口提供了HLA匹配的iPSCs。许多供体，包括建立iPSC的7个供体，不仅在HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1等位基因纯合，也在HLA-C、HLA-DQB1和HLA-DPB1等基因上纯合。
生产临床级别的iPSCs
使用符合捐赠者筛选和验收测试条件的外周血单核细胞（PBMCs）或脐带血（CB）细胞作为实验材料。根据此前发表的方法，从每个实验材料中扩增CD34+细胞，并通过电穿孔法转染附着体(episomal)质粒载体以诱导iPSCs。使用了五个载体的组合（pCE-hOCT3/4表达OCT3/4，pCE-hSK表达SOX2和KLF4，pCE-hUL表达MYCL1和LIN28A，pCE-mp53DD表达TP53的显性负性(dominant-negative)形式，pCXB-EBNA1表达EBNA1）。关于单倍体的生产，在项目过程中对方法进行了修改，以提高效率和减少传代次数，从而形成了三种方法（图1）。在方法1和方法2中，集落被挑选、扩增，并作为原始细胞群（PCS）系单独冷冻保存（图1）。重编程的效率约为0.01%-0.06%。这些结果与Okita等人研究结果一致。由于在方法1建立的细胞系中经常观察到低水平但可检测到的残留重编程载体，因此在方法2中引入了限制性稀释过程。从每个供体产生多个PCS系，并使用供体ID和系号（如QHJI01和RWMH12）来命名。通过下文描述的筛选测试的PCS系被转移到多孔板中，扩增，并作为二级细胞储备（SCS）系冷冻保存。因此，从每个PCS系中产生多个SCS系，并使用相应的PCS名称、SCS的 "s "和系号（如QHJI01s01）来命名。该方案被进一步修改以减少细胞库存的传代次数。电穿孔后，不挑选菌落，也不直接从细胞群落中制作PCS系（方法3；图1）。在方法3中，产生了多个SCS克隆，用供体ID、SCS的 "s "和克隆编号（如GLKVs16）来命名。由于这一修改，SCS系的传代次数从方法1和2的p9或p10减少到方法3的p7。作为过程控制，在所有的细胞培养过程中都进行了无菌和支原体测试。所有PCS和SCS品系都是在研究组的细胞加工厂生产、储存和测试的，该工厂已获得日本卫生、劳动和福利部的批准。我们制造过程中使用的所有原材料都符合GMP准则。两种最常用的iPSC品系QHJI01s04和QHJI14s04的主细胞库也是根据ICH Q5指南制造和测试的（https://www.ich.org/page/quality-guidelines）。
iPSC系的质控测试
作为质控测试，研究进行了分步（PCS和SCS）筛选和释放测试。对于PCS筛选，检测残留质粒、进行核型、全外显子组序列（WES）分析和全基因组序列（WGS）分析以检测单核苷酸变异（SNVs）/插入或缺失（indels），SNP阵列和WGS分析以检测拷贝数变异（CNV）和结构变异（SVs）。流式细胞仪检测未分化状态标志物，包括TRA-1-60和SSEA-4，DNA芯片分析检测未分化状态标志物基因和分化缺陷标志物基因，并进行形态学分析。在方法3中，没有进行PCS筛选。对于SCS筛查，进行了与PCS筛查相同的测试，对残留的质粒采用了更严格的标准。由于缺乏先例，很难为PCS和SCS筛选试验制定绝对的接受标准，而且这些试验的验证也很困难。因此，暂时设定了可取标准(preferable criteria)。当来自同一供体的多个iPSC系符合可取标准时，三个PCS系和六个SCS系被选为最大数量。相反，评估值最接近可取标准的PCS和/或SCS系被选中，即使其评估值不符合可取标准。释放测试包括微生物不育性、支原体、内毒素水平、病毒、形态和与亲代血细胞的一致性。所选的SCS系没有一个在释放测试中失败。表S7描述了所有iPSC系的这些质量控制测试结果，并在图2A中进行了总结。
在用这种两步筛选方法测试的92个PCS系和125个SCS系中，最常见的排除原因是检测到残留的质粒。例如，来自供体QHJI的14个PCS系中有7个在每550,000个细胞中保留了100个以上的质粒拷贝，而这是PCS筛选中的可取标准。在来自QHJI01 PCS系的五个SCS系中，有三个系检测到1-5个拷贝/50,000个细胞的Lin28A。我们推测这些低水平的残留质粒是由于质粒被整合到其基因组中的小部分细胞。为了去除这些罕见的细胞群，在SCS制备中加入了单细胞克隆步骤（图1中方法2和3）。
第二常见的排除原因是在PCS和SCS系中存在与癌症相关基因的SNV和indel突变，这些突变列于表S7。癌症相关基因是根据COSMIC癌症基因普查数据库（tier1）和Shibata列表（表S5）选择的。健康的捐赠者被认为不存在有害的突变，在iPSCs中检测到而在亲代血细胞中未检测到的变化被提取出来，然后使用目标特异性扩增子测序确认iPSC特异性改变。普遍存在于不同供体的PCSs或SCSs的突变未被发现（表S7）。在两个来自不同供体的PCS中检测到了BCOR基因的突变，但其变化不尽相同。这一发现表明，在iPSC建立过程中没有引入特定的基因突变。同时，来自每个供体的iPSC系显示出相同的变化，表明它们可能以极低的频率存在于原始血细胞中，这种低频低至无法被扩增子序列分析发现。
第三常见的排除原因是存在CNVs和SVs。特别是11号染色体单亲二体(UPD)在所有捐赠者的iPSCs中被发现，除了QHJI（图2B；表S7）。这些结果意味着Chr11容易发生与用我们的方案建立和/或培养的iPSCs有关的变化。对于DEMS（第五常见的HLA供体），在所有12个建立的SCS中检测到Chr 11 UPD；因此，并非所有细胞系都被释放（表1）。
排除的第四个最常见的原因是未分化标志物的低表达水平，包括TRA-1-60、TRA-2-49和SSEA-4。在流式细胞仪分析中，呈现低TRA-1-60表达的细胞系被排除，即使它们显示出相对较高和均匀的SSEA-4和TRA-2-49表达（图2C-2G；表S7）。
此外，在QHJI PCS系中观察并筛选出了具有核型异常的iPSC系。最值得注意的是，五个PCS系显示了Y染色体的丢失（图2H）。由于与年龄有关的Y染色体缺失在血细胞中很常见，捐献者PBMC中的缺失chrY的细胞可能是缺失chrY的iPSCs的起源。
所有通过SCS筛选测试的SCS系也通过了释放测试。这一结果表明，我们的细胞生产程序符合GMP标准。然而，对于供体YZWJ，在iPSC诱导过程中使用的一种试剂中被发现偏离了GMP标准操作。因此，从该供体中重复生成iPSC（表1）。总的来说，从七个供体中产生了27个临床级iPSCs的SCS系（表1和S7）。
单倍体库中iPSC系的特征分析
已建立的iPSC系表现出典型的胚胎干细胞（ESC）样的集落形态（图3A）。基因表达分析表明，单倍体库中的iPSC系与201B7 iPSC系、409B2 iPSC系和KthES ESC系相似，这些系先前已经建立并在类似的无饲养者培养条件下维持（图3B和S1A）。在PCA结果中，每个供体都有明显的聚类，反映了供体依赖的异质性。导致iPSCs之间差异的一个主要因素是供体的性别，男性和女性系之间有明显的分离。在促成供体特定集群的基因中，许多是与性别有关的基因，如XIST、DDX3Y、RPS4Y、RPS4Y2和TTTY14（图3B）。除了位于性染色体上的基因外，还有一些基因在不同的样本中以供体依赖的方式表达，这可能是由于亲代细胞的表观遗传状态或生产过程中使用的方法不同。
为了确认纯合HLA iPSC系的多能性，研究使用三系分化试剂盒（Stem Cell Technologies）进行体外定向分化。微阵列数据的PCA显示，来自五个供体（QHJI, YZWJ, RWMH, DRXT和GLKV）的iPSC系显示出与ESCs类似的三系分化潜力（图3C）。此外，用SFEBq方法测试了iPSC系的神经分化潜力，证实所有iPSC系都分化为NCAM阳性细胞，并失去TRA-1-60免疫反应性（图3D-3H）。
构建的iPSC单体库的医学应用
截至2022年9月底，已建立的iPSC系被提供给30家机构用于临床，62家机构用于研究（表S9）。迄今为止，使用这些细胞系进行的临床研究和临床试验列于表3。研究组的任务不仅是向这些用户提供iPSC系，而且还要与他们保持沟通，以跟踪长期临床结果。截至2022年10月7日，我们还没有收到任何与移植细胞相关的严重不良事件的报告，如排斥或致瘤性。每位使用者都有一个数年的随访计划，并将相应地报告结果。
讨论
本研究报告了从7个HLA纯合子供体构建的一个临床级iPSCs单倍体库。研究描述了符合GMP标准的生产方法和用于临床应用的分步质控测试。表S10中列出了生产临床级iPSCs的指南。单倍体库中的细胞系已被用于多个临床试验，以治疗各种疾病和损伤，如黄斑变性、角膜干细胞衰竭综合症、帕金森病、心力衰竭、软骨缺陷和脊髓损伤。iPSC单倍体库的产生及其临床应用为进一步开发利用iPSC的细胞疗法提供了宝贵的见解。
该单倍体库的意义在于它为使用者提供了多种临床级别的iPSC系。该单倍体库由来自7个HLA纯合子供体的27个iPSC系组成。因此，用户可以选择最适合他们应用的iPSC系，这很重要，因为iPSC克隆，即使是来自同一供体的克隆，也表现出分化倾向的差异。值得注意的是，两个目标是心肌细胞的用户选择了同一个SCS克隆（QHJI14s04），而多个目标是外胚层组织的用户选择了另一个SCS克隆（QHJI01s04）。这些结果表明，每个iPSC品系都拥有独特的分化倾向，预选多个品系对下游应用至关重要。研究确认提供的iPSCs可以分化成三个胚层（图3C），但三系检测并不能预测分化成更成熟的细胞的倾向，如心肌细胞。为了方便用户的预选，研究提供了从临床级品系降级的研究级品系。
本文提到的iPSC系也可以在日本以外的国家使用。用户之一住友制药(Sumitomo Pharma)，正准备在美国进行临床试验，并已向美国食品和药物管理局（FDA）咨询。根据FDA的建议，研究者与捐赠者（QHJI）进行了另一次面谈，以获得更多的知情同意，并取得了血液样本进行额外的测试，包括西尼罗河病毒的测试。结果，FDA确认捐赠者QHJI有资格在美国使用iPSC衍生的多巴胺能祖细胞进行帕金森病的临床试验。其他捐赠者很可能会以类似的方式在美国获得资格。
单倍体库的另一个重要优势是，它可以为大约40%的日本人口提供HLA匹配的iPSC系。高桥等人将QHJI01s04系用于五名HLA匹配的黄斑变性患者，并观察到所有病例的移植细胞都成功得到了移植，而不需要全身服用免疫抑制剂，这证实了从HLA同型供体产生的iPSC系的实用性。利用HLA纯合子供体首次由ESC库提出。据估计，10个品系可覆盖50%的日本人口，另外10个品系可覆盖英国35%的人口。然而，识别罕见的HLA纯合子供体是一个障碍，在日本红十字会的支持下，研究克服了这一障碍。红十字会拥有大量血小板、骨髓和脐带血潜在供体的HLA单倍型数据库。与现有生物库的这种合作是基于iPSC的单倍体库的一个优势。
一个重要的挑战是覆盖其余60%的日本人口和更加多样化的全球人口。通过与日本红十字会的合作，研究确定了除了最常见的四种单倍型之外24种不同HLA单倍型的纯合子捐赠者，他们同意参与单倍型库。如果我们从这些捐赠者中制备iPSC系，大约60%的日本人口将被覆盖。然而，我们仍然无法覆盖其余40%的人口。要覆盖所有其他种族，需要付出巨大的努力，这在实际中可能并不可行。
另一种策略是使用基因编辑的“HLA隐身”。例如，所有的MHC I类抗原可以通过删除β-2微球蛋白基因来抑制。然而，MHC 1的丧失可能会导致肿瘤特异性抗原的提呈失败，从而增加肿瘤发生率。为了克服这个问题，我们现在正在生产仅保留HLA-C的"C-only "iPSC系，其HLA-A和HLA-B被删除，MHC II类抗原通过CII转录因子的失活被抑制。我们预期完整的HLA-C将支持肿瘤特异性抗原的提呈。我们将基因编辑应用于HLA纯合的iPSC系，这些系已经在临床试验中被采用。我们预计这些品系在基因编辑后将保持其首选的分化倾向，尽管需要进行实验确认。此外，通过使用HLA纯合系，我们可以减少gRNA的数量，以删除HLA-A和HLA-B的两个等位基因和HLA-C的一个等位基因。传统的iPSC系需要5个gRNA，而HLA纯合的 iPSC系只需要两个，一个用于HLA-A，另一个用于HLA-B。我们预测，大约10个HLA-C iPSC系将足以覆盖全球大部分人口，因为HLA-C的多样性比HLA-A或HLA-B少。
在细胞治疗中，iPSCs的理想使用途径是自体移植。然而，一个艰巨的挑战是成本问题。目前，从一个捐赠者那里生产iPSC系大约需要4000万日元（约30万美元）。为了克服这个问题，可能需要如上所述的自动化和封闭式培养系统。我们很可能需要一个不依赖集落采集和克隆的程序，因为这些操作很耗时，而且很难实现自动化。许多障碍需要克服，包括上文讨论的iPSC系的异质性。另一个障碍是消除外源性重编程因素。即使使用修改后的方法，许多已建立的iPSC系显示出质粒DNA的基因组整合。使用非整合的基因传递方法，如仙台病毒和mRNA，或化学重编程方法可能更适合于生产自体iPSC系。
另一个重要的问题是癌症相关基因的基因突变。在大约五分之一的PCS和SCS候选者中，我们的WGS/WES分析在iPSCs中检测到癌症相关基因的非同义SNVs/indels，但在父母的血液样本中没有。不同品系之间没有发现共同的突变。最近，有报道称BCOR基因经常发生突变。我们在两个PCS系和一个SCS系中检测到BCOR基因的突变，但变化不尽相同。与以前的报告不同的是，在ESCs中经常检测到显性阴性的TP53基因突变，而只有一个来自供体RWMH的PCS系中检测到TP53基因突变。我们排除了在WGS检测的癌症相关基因中含有一个或几个SNVs/indel(s)的iPSC系，以根据日本的再生医学指南，最大限度地提高合子库的安全性。
我们发现解释癌症相关基因的突变的功能意义是一个挑战。在这项研究中，我们的WGS分析使用了大约70x的深度，在每个捐赠者中检测到大约50个非同义的SNV/indel突变，这些突变在亲代血样和后代iPSC系中很常见，并且没有被列入SNP数据库。这些发现，加上供体在生成iPSC时是健康的，排除了这些癌症相关基因的突变与致瘤性的直接关系。我们的结果与以前对10个iPSC系的WES分析结果一致，该研究的深度约为40x，在每个系中检测到约70个与癌症相关基因的非同义突变。这些研究发现，大多数被确认的突变也存在于亲代成纤维细胞中，清楚地表明许多与癌症相关基因突变不会导致癌症。因此，为WGS设定一个确定的标准是不现实的。WGS所需的成本和时间是另一个问题。如果每个细胞系都需要进行WGS分析，那么从成千上万的供体中产生自体iPSCs将是困难的。一个可能的选择是对一组确定的基因进行测序，如TP53和BCOR。WGS分析对iPSC系的质量控制的效用值得进一步讨论。
此外，我们在来自多个供体的几个iPSC系中检测到Chr11q22.1-25的单亲二体(UPD)。因此，我们将这些iPSC系从单倍体库中排除。UPD的频繁出现是多克隆生成iPSCs的另一个障碍。这种特殊的UPD在其他ESC和iPSC系中没有报道过。我们推测，UPD可能是由于用于提高重编程效率的p53显性阴性突变体造成的，因为有报道称急性骨髓性白血病的p53改变与UPD之间存在关系。
总之，研究报告了从HLA纯合子供体中产生的iPSC单倍体。单倍体库中的细胞系已被用于多项临床试验。此外，该单倍体细胞库的经验提供了关于异质性、致瘤性和免疫原性的重要见解，这些需要更好地得到控制，以使基于iPSC的细胞疗法得到广泛使用。
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▌论文标题：
A clinical-grade HLA haplobank of human induced pluripotent stem cells matching approximately 40% of the Japanese population
▌论文网址：
https://www.cell.com/med/fulltext/S2666-6340(22)00450-0
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.medj.2022.10.003
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