四川大学杨阳/魏于全/陆方合作纠正遗传性视网膜变性小鼠的突变和表型

先导编辑器(PE)可以编辑几乎任何预期更改的基因组，包括所有12种可能的碱基替换、小插入和删除及其组合，而不需要双链断裂或外生供体模板。PE证明了纠正各种致病突变的可能性，并可能扩大基因编辑的治疗应用。

2023年2月6日，四川大学杨阳，魏于全及陆方合作在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38）在线发表题为“Dual-AAV split prime editor corrects the mutation and phenotype in mice with inherited retinal degeneration”的研究论文，该研究表明双AAV介导先导编辑器能够纠正遗传性视网膜变性小鼠的突变和表型。该研究发现，用Rma内含肽在SpCas1105的氨基酸9(Ser)之前分裂PE可以产生最高的靶向编辑。进一步优化了pegRNA和nicking sgRNA在AAV载体中的取向。

为了测试优化的双AAV介导先导编辑器的体内性能，通过视网膜下注射将其用于患有遗传性视网膜疾病Leber先天性黑蒙的rd12 小鼠。先导编辑器以精确的方式纠正了致病性突变，效率高达16%，没有检测到脱靶编辑，恢复了RPE65的表达，挽救了视网膜和视觉功能，并保留了感光器。总之，该研究的发现为PE的临床前开发建立了一个框架，并激励PE用于治疗各种突变引起的遗传性视网膜疾病的进一步测试。

遗传性视网膜疾病(IRD)是全球致盲的主要原因，其特征是光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)变性。它是一组与超过250个基因突变相关的异质疾病。这组疾病的遗传模式各不相同。尽管在过去的十年中，这些疾病的治疗方法取得了非凡的进展，包括RPE65相关的莱伯氏先天性黑蒙(LCA)的基因治疗已获批准，目前某些隐性IRD的临床试验也得到了批准，但大多数IRDs仍然无法治愈。基于CRISPR的基因编辑技术的发展使得纠正广泛的基因突变成为可能。

PE是一种新的基于CRISPR的工具，可以在不需要双链断裂(DSB)或外源供体DNA模板的情况下进行精确的基因组编辑。PE2由催化受损的SpCas9 H840A和工程逆转录酶(RT)组成。然后PE2与一个pegRNA形成一个复合物，pegRNA携带一个单导RNA (sgRNA)和一个3 '延伸，其中包含具有所需编辑和引物结合位点(PBS)的RT模板。

PE3由PE2、pegRNA和一个nicking sgRNA组成，在未编辑链上诱导缺口以增强启动编辑活性。PE可以编辑几乎任何改变的基因组，包括所有12种碱基替换、小插入和删除以及它们的组合。PE具有独立于其组成的精确纠正致病突变的能力，这使得PE成为治疗具有广泛突变谱的IRDs的非常有前途的方法。

双AAV8 split-PE3在rd12小鼠视网膜下传递纠正突变并恢复Rpe65的表达（图源自Signal Transduction and Targeted Therapy ）

为了提高PE的编辑效率，人们已经在PE本身上做了很多努力。然而，作者认为优化PE的传递途径来提高体内效率是另一种选择。同时，PE在体内安全高效的给药是其临床应用前的一个重大问题。腺相关病毒(AAV)由于其良好的安全性，是遗传物质在体内传递最常用的载体。然而，它有限的封装容量(~5 kb)对于大量的PE结构(~6.3 kb)是不够的。为了将PE与AAV结合，作者使用了分裂-连接蛋白策略，其中PE被分裂为氨基端(N端)和羧基端(C端)组分，随后通过反式连接蛋白重新组装成全长PE。

在该研究中，通过优化基于断裂蛋白质内含子和双AAV载体的先导编辑器，作者在rd12小鼠的眼睛中实现了有效和精确的启动编辑，并证明了相当程度的视力恢复。该研究发现先导编辑器在纠正导致IRDs的突变和恢复视觉功能方面具有临床潜力。总之，该研究为针对不同突变引起的其他IRDs的启动编辑疗法的临床前开发提供了框架。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41392-022-01234-1

转自：“iNature”微信公众号

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