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点击化学和生物正交化学中的化学基础概念和前沿思想——2022年诺贝尔化学奖浅析
李恒宇1，赖铖阳1，黄思齐2，陈兴1,*
1北京大学化学与分子工程学院，北京 100871
2北京大学附属中学道尔顿学院，北京 100190
摘要：2022年诺贝尔化学奖授予了Carolyn R. Bertozzi、Morten Meldal和K. Barry Sharpless三位科学家，以表彰他们开创了点击化学和生物正交化学。点击化学源于对有机合成方法学的改进，提供了一种在温和条件下高效快速地偶联化学分子的新方法。生物正交化学的开发则起始于生命体系中糖质生物大分子的特异性标记和成像，发展出一类不干扰生命体系且不受生命体系干扰的连接反应。二者殊途同归、异曲同工，成为了在化学、生物医药和材料科学等领域中应用最为广泛的一类化学反应。本文从点击化学与生物正交化学开发中所涉及的化学基础概念出发，对这两种方法的前沿思想进行简要探讨。
关键词：诺贝尔化学奖；点击化学；生物正交化学
中图分类号：G64；O6
DOI: 10.3866/PKU.DXHX202212058
正文
2022年10月5日，瑞典皇家科学院宣布将2022年诺贝尔化学奖颁发给美国化学家Carolyn R. Bertozzi、丹麦化学家Morten Meldal和美国化学家K. Barry Sharpless，以表彰他们开创并发展了点击化学和生物正交化学(图1a) [1]。
图1 (a) Bertozzi (中)、Meldal (左)和Sharpless (右)三位科学家因开创点击化学和生物正交化学
获得2022年诺贝尔化学奖；(b) 以一价铜催化的叠氮-炔环加成为代表的点击化学;
(c) 基于生物正交化学的非天然糖代谢标记
图1b修改自Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences；
图1c修改自文献Nat. Chem. Biol. 2005, 1, 13
点击化学(click chemistry)的概念由Sharpless于2001年创造并提出，指的是一类模块化、高选择性、条件温和、高产率的偶联反应，以实现功能分子的高效快速合成[2]。在传统的有机合成化学中，为了追求产率和效率，分子骨架的构建通常需要在有机溶剂中进行，并使用升温、酸或碱、惰性气体保护等条件。很多有机反应还需要对活泼基团进行预先的保护，导致合成过程变得复杂和繁琐。羟醛缩合就是这类反应的一个典型例子，常在复杂分子合成中用以构建碳-碳(C―C)键。相反地，大自然则熟练地在常温、中性pH的水溶液中引发各种生化反应，将各种单体分子模块，通过脱水缩合形成碳-杂原子(C―X)键，合成各种生物大分子。师法自然，点击化学的核心思想是强调反应的高效性和功能性。2002年，Sharpless和Meldal分别独立报道了一价铜催化的叠氮-炔环加成(copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反应(图1b) [3,4]。这个反应在高分子、药物分子、材料等的合成中迅速得到广泛应用，成为点击化学“皇冠上的明珠”[5,6]。
生物正交化学(bioorthogonal chemistry)的概念由Bertozzi于2003年正式提出，指一类应用于生命体系的快速、选择性标记反应，这类反应与生物体内的生物化学过程互不干扰，相互“正交”[7,8]。实际上，生物正交反应的开发可以追溯至20世纪90年代末Bertozzi课题组为解决糖质(glycan)标记难题所做的工作[9]。细胞作为生命体的基本组成单元，其微小体积下的内部结构却是复杂和拥挤的，需要依赖各种生物分子的协调配合才能行使正常的生物学功能。为了在细胞中研究糖质这一重要生物大分子的功能，Bertozzi课题组发展了非天然糖代谢标记(metabolic glycan labeling)技术，将含有生物正交反应基团的单糖代谢整合到糖质中，继而利用生物正交反应连接荧光探针，实现糖质特异性标记和观测(图1c) [10]。1997年，他们运用醛酮和酰肼的偶联反应，对细胞表面的唾液酸化糖质进行化学标记[11]。然而，醛酮-酰肼偶联反应需要酸性条件，不利于活细胞标记。为了解决这一问题，Bertozzi课题组1998年开发了叠氮和三苯基膦之间的Staudinger连接反应，这是第一个生物正交反应[12]。尽管Staudinger连接反应在糖质标记等生物标记中得到了广泛的应用，但它仍存在反应速率不够快等不足。另一方面，CuAAC反应具有极佳的反应动力学，然而一价铜催化剂具有细胞毒性，限制了其在生物标记中的应用。为了克服铜毒性的问题，2004年Bertozzi课题组报道了叠氮-环辛炔之间的环张力促发叠氮-炔环加成(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)反应，也被称为无铜催化的点击化学反应(copper-free click chemistry) [13]。随着生物正交化学的发展，非天然糖代谢标记也成为了在活细胞和活体中糖质标记和功能解析的主要方法之一[14]。
从此，生物正交化学和点击化学逐渐被统一起来，二者分别从生物正交标记和有机合成方法学出发，殊途同归，成为了在化学合成、生物标记、材料制备等领域最重要的化学反应工具之一。作为在合成化学和化学生物学领域的开创性方法，点击化学成功地借鉴了自然界合成生物分子的化学机制，而生物正交化学成功地建立了探究生命科学的化学方法，可以说它们分别是“源自生命的化学”和“探索生命的化学”。实际上，点击化学和生物正交化学的开发和建立，运用了许多有机化学和物理化学的基础概念和理论。本文就这些基础概念进行一些探讨，以期对读者思考和探索化学前沿有些许启发。
1 从Staudinger反应到Staudinger连接反应
1.1
叶立德和Staudinger反应
叶立德(ylide)又称邻位两性离子，通常指第三周期元素与碳或氮结合，碳原子或氮原子带负电荷、杂原子带正电荷且均保持完整电子隅的一类化学结构，以磷叶立德和硫叶立德最为常见。磷叶立德的磷原子可以利用其3d轨道和碳原子或氮原子的p轨道形成具有强极性的p–d π键，具有很强的亲核性(图2a)。在Wittig反应中，磷叶立德与酮或醛的羰基发生亲核加成，形成烯烃(图2b)。磷叶立德也常被称为Wittig试剂。1919年，德国化学家Hermann Staudinger报道了叠氮化物与膦之间的Staudinger反应[15]。以三苯基膦和叠氮化物的反应为例，磷原子亲核进攻叠氮基团末端的氮原子后生成氮杂四元环中间体，随后氮气离去生成氮杂磷叶立德，最终水解生成胺和三苯基氧膦(图2c)。由于所形成的中间体会释放氮气，Staudinger反应具有较强的驱动力和较快的反应速率。
图2 (a) 磷叶立德结构式；(b) Wittig反应；(c) Staudinger反应；(d) Staudinger连接反应
1.2
Staudinger连接反应的驱动力改良
叠氮基团在细胞中不存在，且在生理条件下具有优异的化学稳定性，具备作为生物正交反应基团用于非天然糖代谢标记的基本条件。要实现糖质的生物正交标记，则还需要开发对叠氮进行连接的生物正交反应。尽管Staudinger反应具有良好的反应动力学，但是最后一步水解使得两种反应物无法生成偶联产物。基于这些考虑，Bertozzi课题组于2000年对Staudinger反应的驱动因素进行了改良，报道了终产物为偶联形式的Staudinger连接反应[12]。开发该反应的关键是在三苯基膦的一个苯环的邻位接上甲酸甲酯，因而所形成的氮杂磷叶立德不发生水解，而是生成五元环内酰胺，最后水解形成偶联产物(图2d)。
相比于传统的Staudinger反应，Staudinger连接反应的驱动力在以下两方面发生了改变。首先，苯甲酸甲酯的羰基碳原子受到氮上孤对电子的进攻，形成酰胺。对于羧酸衍生物，在酸催化或碱催化下发生亲核取代的反应活性从高到低依次为：酰卤>酸酐>酯>酰胺[16]。相比于苯甲酸甲酯，生成的酰胺具有更高的稳定性，因此在氮上孤对电子的进攻后甲氧基易于离去而生成酰胺，然后再发生水解。再者，氮原子进攻为分子内反应，且生成五元环。根据张力学说，五元环、六元环具有最好的稳定性[16]。因此，这两种驱动力使得反应朝着形成内酰胺的方向进行。
通过增加以上两种反应驱动力因素，Bertozzi课题组成功地将Staudinger反应从一个非连接反应改造为连接反应，成功开发出了叠氮与三苯基膦之间的生物正交反应。在生物正交化学的发展历程中，Staudinger连接反应被普遍认为是第一个真正意义上的生物正交反应，也被称为Staudinger-Bertozzi连接反应。
2 一价铜催化的叠氮-炔环加成反应
2.1
1,3-偶极体和叠氮-炔的1,3-偶极环加成
1,3-偶极体(1,3-dipole compound)是一类具有三原子四电子π体系，可以用偶极共振式来描述的化合物，例如臭氧、重氮甲烷和叠氮化合物等。这类化合物具有与烯丙基负离子类似的分子轨道，能与烯烃、炔烃等亲偶极体发生环加成反应，生成五元环状化合物。根据前线轨道理论，化学反应的发生要求一个反应物分子的HOMO轨道和另一反应物分子的LUMO轨道对称性匹配且能级接近[17]。对于1,3-偶极环加成反应，在符合这些要求的情况下，可以根据1,3-偶极体的不同分为若干反应类型。
1960年代初，德国化学家Rolf Huisgen报道了一种叠氮化物与炔基化合物之间的1,3-偶极环加成反应[18]。在加热条件下，两种反应物发生总电子数6π体系的协同反应，经过五元环过渡态生成1,2,3-三氮唑并放出热量(图3a)。这个[2+3]环加成反应大量放热，且叠氮基和炔基均可在水相、开放的环境中稳定存在，符合Sharpless所提出点击化学基本要求的其中几点。然而，该反应历程中形成五元环状过渡态的活化能较高，因而需要加热以提高反应速率。此外，对于碳碳三键两端取代基不同的炔基化合物，该反应的区域选择性较差，得到的是1,4-取代和1,5-取代的两种产物的混合物。因此，如要将叠氮-炔间的1,3-偶极环加成开发成点击化学，需要从降低活化能和提高区域选择性两方面进行优化。
图3 (a) Huisgen叠氮-炔环加成反应；(b) CuAAC反应；(c) SPAAC反应
2.2
一价铜催化的叠氮-炔环加成反应
2002年，Sharpless和Meldal分别独立发现一价铜催化剂可以完美地解决上述问题[3,4]。碳碳三键能够和一价铜离子形成配位键，而且末端炔基容易电离氢离子并和另一个一价铜离子配位形成炔基铜化合物。随后，叠氮取代另一个配体与一价铜键合，炔基β碳原子亲核进攻叠氮末端氮原子，形成一个独特的六元环中间体，铜由一价变为三价。这一反应中间体不稳定，容易发生缩环产生稳定性更好的五元芳香杂环化合物，并使铜从三价回到一价，最终完成催化循环(图3b) [19]。由于一价铜在水溶液中不稳定，通常由抗坏血酸钠等还原剂原位还原二价铜产生。除了一价铜以外，其他二价钌也被发现可以催化这一反应[20]。
根据催化反应动力学理论，催化剂通过改变反应途径从而降低反应活化能，提高反应速率[21]。在一价铜的催化下，叠氮-炔环加成反应的反应途径发生了改变，活化能大幅降低，使得该反应可以在常温下高效快速进行(图4a)。除了优异的反应动力学外，CuAAC反应还具有一系列优点。例如，该反应既可以在有机溶剂中进行，也可以在水相和醇溶剂中发生。CuAAC反应对底物兼容性很好，并且基本不受其他活性官能团的干扰。该反应所产生的三氮唑产物通常易于纯化。这些特点使得CuAAC成为了一个简单易用且温和高效的反应，迅速得到大量的应用，也成为了点击化学的代名词。
图4 (a) CuAAC反应通过一价铜离子催化剂改变反应过渡态，从而降低反应活化能；
(b) SPAAC反应通过环张力活化反应物，从而降低反应活化能
3 环张力驱动的叠氮-炔环加成反应
Bertozzi课题组于2004年报道的SPAAC反应则利用环张力来取代一价铜催化剂，从而解决CuAAC在生物应用中的毒性问题(图3c) [13]。除了通过合适的催化剂来降低反应的活化能(图4a)，提高反应物自身的能量也可以使活化能降低(图4b)。根据这一思路，Bertozzi等人设计了八元环炔类化合物。由于炔基的碳碳三键中的碳原子是sp杂化，键角为180°，八元环的张力使得环辛炔活性增加，可以在室温下与叠氮基高效快速地发生反应。更小的环炔(如环庚炔和环己炔等)则由于环张力过大，在室温下不稳定。当然，SPAAC也不可避免地会得到1,4-取代和1,5-取代的两种产物。不过，对于生物标记的应用来说，这一影响不大。SPAAC也被称为无铜催化的点击化学，在实际应用中也渐渐模糊了点击化学和生物正交化学的界线，逐渐将两种化学反应统一起来。
4 结语
点击化学和生物正交化学是化学概念和理念上的创新和突破。纵观现代科学的发展历程，科学新发现和新概念是最重要的两类驱动力，而且这两者之间是相辅相成、相互促发的。Sharpless教授在2001年前瞻性地提出了点击化学的概念，开创了点击化学这个领域。这应是得益于这位最富创造性的化学家长期以来对有机化学合成在理念层面深入的思索。Sharpless课题组还于2014年开发出了“第二代”点击化学——六价硫氟交换(sufer(VI)-fluoride exchange，SuFEx)反应，继续引领点击化学的发展前沿[22]。Bertozzi教授则在2003年归纳了其课题组在之前5年利用化学标记进行糖质成像的工作，抽象并提出了生物正交化学这一全新的概念，从而促进这个领域的迅猛发展。当前，生物正交反应仍然是化学生物学中最活跃的一个方向，发展出了包括反式环辛烯和四嗪分子之间的Diels-Alder反应等一系列新型的生物正交化学[23]。在实际学习和科学研究中，我们往往会在一定程度上忽视提出和归纳新概念的重要性。点击化学和生物正交化学概念的提出，值得我们认真体会和借鉴。
重大的科学突破常常离不开基本知识和原理。点击化学和生物正交化学的开发和发展过程，正是化学基础概念在解决前沿科学问题中发挥关键作用的体现。三位科学家巧妙地运用化学的基础概念和原理，对传统的化学反应进行改造，使之成为目前在化学、生命科学、材料科学等领域具有广泛应用价值的化学反应。这也再次提醒我们，扎实掌握基础知识是取得科学前沿突破的必要条件。
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作者简介
陈兴
北京大学化学与分子工程学院教授、院长。兼任北大-清华生命科学联合中心高级研究员、北京大学合成与功能生物分子中心研究员。2002年本科毕业于清华大学化学系（导师：李亚栋教授），2007年获加州大学伯克利分校化学博士（导师：Carolyn Bertozzi教授和Alex Zettl教授），随后在哈佛大学医学院从事博士后研究（导师：Timothy Springer教授）。2010年加入北京大学化学学院，2016年晋升为北京大学长聘正教授。获2014年度国家杰出青年科学基金资助，入选教育部2018年度长江学者特聘教授。曾获张树政糖科学杰出成就奖、科学探索奖、陈嘉庚青年科学奖、Okeanos-CAPA资深研究员奖、中国化学会-英国皇家化学会青年化学奖、美国化学会Horace S. Isbell Award、David Gin New Investigator Award、国际糖复合物组织Young Glycoscientist Award等。目前的研究兴趣主要集中于化学和糖生物学的交叉领域。以“活细胞和活体上的糖质标记和功能解析”为核心，开发糖质化学标记、成像和组学分析方法，解决糖科学中的重要问题，推进对相关人类疾病发生机制的研究和理解。
引用本文
李恒宇, 赖铖阳, 黄思齐, 陈兴. 点击化学和生物正交化学中的化学基础概念和前沿思想——2022年诺贝尔化学奖浅析[J]. 大学化学, 2023, in press. doi: 10.3866/PKU.DXHX202212058
Hengyu Li, Chengyang Lai, Amelia Siqi Huang, Xing Chen. Basics and Frontiers of Click Chemistry and Bioorthogonal Chemistry: A Brief Introduction to 2022 Nobel Prize in Chemistry[J]. Univ. Chem. 2023, in press. doi: 10.3866/PKU.DXHX202212058
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