华中农业大学王鹏蔚课题组提出园艺研究中蛋白亚细胞定位的常见问题与解决方案

真核细胞为了确保同时进行不同的生化反应，进化出了多种膜结构细胞器。这些生化反应通过参与信号转导、囊泡运输及和膜相互作用的蛋白质协调完成。因此，确定蛋白质的亚细胞定位是研究其功能的重要一步。在园艺植物相关研究中，获得稳定的转基因植物对大多数物种来说仍然具有挑战性，因此，人们通常使用烟草叶片瞬时表达系统，将感兴趣的蛋白与荧光细胞器Marker共同表达，并通过共聚焦显微镜成像确定园艺植物相关蛋白的定位，但是由于相关成像标准的不统一，不可避免的影响了一些结论的可靠性。

2022年12月，Horticulture Research上线了（Advance Access）华中农业大学园艺林学学院王鹏蔚课教授题组题为Protein subcellular localization and functional studies in horticultural research: problems, solutions, and new approaches 的文章，列举了一些研究中发生的不适当的图像采集的例子，并就目前园艺相关研究中存在的这些问题提出了建议和解决方案。

首先一个问题是在不适当的焦平面拍摄的图像可能难以准确解析蛋白质定位。例如，在成熟的叶细胞中，90%以上的体积被液泡占据，所有细胞质及细胞器都被挤在细胞皮层区（图1）。在这个密闭空间内的荧光蛋白标记的亚细胞结构之间的距离接近普通光学显微镜的分辨率极限。因此，如在细胞的中间部分成像，则难以区分差异，并且信号分布分析倾向于在所有测试中显示强烈的共定位。特别是当研究与细胞质结构相关或定位于细胞质的蛋白质时，它们的定位可能与质膜或细胞质背景难以区分。为了解决这一问题并获得大多数细胞器（细胞核除外）最佳成像结果，我们建议从叶表皮细胞的皮层部分拍摄图像，这是位于液泡膜（液泡体）和质膜之间的细胞质层（大约0.5-1微米厚）。此外，一些分泌的膜蛋白（例如分布在PM或液泡）的过量表达可能会导致其被困在一些中间室并产生错误定位。例如，水通道蛋白（PIP2A）通常用作细胞质膜的Marker。然而，当其表达水平过高时，PIP2A在内质网中积累，不能有效地运输到细胞质膜。在内质网中合成的其他分泌膜蛋白中也可能发现类似的效应。因此，在实验中确保蛋白被正确定位是至关重要的，使用较低浓度的农杆菌（OD600 < 0.05）进行瞬时表达可能会有所帮助。

图1 不同Z轴向位置拍摄图像的模式图

然而，蛋白质表达水平因细胞而异，因此有时研究人员很难确定蛋白质最优表达浓度和正确定位的细胞。为了更好地克服这些问题，我们构建了一系列稳定的N. Benthamiana细胞器Marker表达系（图2）。其中包括线粒体Marker系MT-RFP，自噬体Marker系GFP-ATG8a，质膜Marker系PIP2A-CFP，质体Marker系PT-RFP，微丝Marker系GFP-Lifeact，微管Marker系RFP-TUA5。荧光标记在这些植物中表现出统一的表达水平和正确的亚细胞定位，它们可用于蛋白质共定位研究并产生更稳定和一致的结果，并且可以用于亚细胞水平的蛋白功能研究。在本研究中，以稳定的微管Marker系RFP-TUA5为例，研究了不同微管调节因子对微管动态的调节功能。

图2 稳定的N. Benthamiana细胞器Marker表达系

华中农业大学园艺林学学院博士研究生郭晔，博士后暴志茹博士为本文的共同第一作者。华中农业大学王鹏蔚教授蔚论文通讯作者。本项研究得到了国家重点研发计划项、自然科学基金面上项目、细胞器互作重大研究计划等项目的支持。

作者团队介作总结

王鹏蔚教授实验室长期致力于研究植物内质网-细胞器互作的分子机制与生物学功能，重点关注细胞器互作网络、细胞骨架在选择性自噬、植物生长与果实发育等方面的作用。

文章链接：

https://doi.org/10.1093/hr/uhac271

转自：“园艺研究”微信公众号

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