构建拟南芥接头蛋白复合体相互作用图谱

接头蛋白(AP)复合物是在进化上保守的囊泡转运调节因子，它募集包被蛋白、膜货物和包被囊泡辅助蛋白。正如植物内吞作用和后高尔基体转运在跨高尔基体网络中交互一样，预计将有独特的机制对重叠水泡路线的物质进行筛选分类。植物 AP 复合物是分选机制的一部分，尽管有一些功能信息，但是它们的载体、辅助蛋白和调控仍然很大程度上是未知的。

近日，来自比利时根特大学Eugenia Russinova团队在国际著名杂志Nature Plants杂志上发表了一篇题为“Adaptor protein complex interaction map in Arabidopsis identifies P34 as a common stability regulator”的研究文章，文章报道了拟南芥接头蛋白（AP）复合体相互作用的图谱，并表明了 P34是一种常见的稳定性调节因子。

膜内在蛋白的转运从内膜系统的一个区室运输到另一个区室的目的地对于所有真核细胞来说是必不可少的。这种转运主要由包被囊泡介导，包被囊泡是通过将包膜蛋白招募到特定的膜室中形成的，在那里它们结合适配器和其他辅助分子，以促进膜弯曲并收集囊泡货物。这个过程的关键是细胞内物质分类的微控制，它依赖于物质蛋白内的信号和特定的衔接蛋白(AP)复合物介导的货物识别。五个 AP 复合物，命名为AP-1至AP-5，每个都参与一个独特的囊泡运输途径，已经在高等真核生物中被鉴定出来。五个AP复合物是含有两个大亚基(β1至 β5和γ，α，δ，ε和ζ) ，一个中等亚基(μ1至μ5)和一个小亚基(σ1至σ5)的异四聚体蛋白质。另外，与AP-2一起，在植物细胞的质膜中也需要一种古老的异染色体接头复合物，称为TPLATE复合物(TPC)。TPC的单个亚基的敲除导致雄性不育，而沉默触发了幼苗的致死性，并消除了内吞通量。

为了进一步了解五种AP复合物和TPLATE复合物（TPC）在植物中的功能，研究人员在拟南芥细胞悬浮培养物中进行了靶向相互作用筛选。为此，研究人员进行了一系列的串联亲和纯化实验(TAP)、单步AP-MS和PL-MS实验。以前，这些相互作用组分析已经成功地用于鉴定拟南芥中的核心AP-2和TPC。通过AP-MS实验，整合所有相互作用组分析，包括进一步的网络扩展，我们在536种蛋白质中产生了926种相互作用的综合网络（图一）。

图一、六种AP及其辅助蛋白的综合相互作用网络

接下来，研究人员鉴定了拟南芥的AP-5复合体，为了发现AP-5的核心复合物和辅助蛋白，使用AP5B和AP5M作为单步AP-MS的诱饵。在AP-5网络中总共存在59种蛋白质之间的102种相互作用，并且所有三个AP-5亚基与植物含有锌指结构域的蛋白质(AT2G25730)和 SPATACSIN羧基末端蛋白(AT4G39420)中迄今为止未表征的蛋白质一起被鉴定。这些发现意味着除了AP-1，AP-2和TPC的亚群之外，AP-5，AP-3和AP-4调节的囊泡运输途径之间存在串扰。另外，为了深入了解 AP 复合物相互作用伙伴的功能，研究人员分析了基因本体(GO)富集。所有鉴定的蛋白质都富含与蛋白质转运和分子代谢相关的 GO术语。单个AP复合物的GO分析显示与AP-1，AP-2，AP-3和TPC相关的蛋白质存在于“胞吞作用”中，而AP-4和AP-5的蛋白质富含“溶酶体转运”。与辅助蛋白P34，BAG4，AAK1，ECA1，ECA4和CAP1伴随的蛋白质与术语“ CME”和“clathrin coat assembly”配对。表明了拟南芥AP 复合体的功能多样性。

由于 AP-5尚未在植物中表征，研究人员验证了AP-5亚基与免疫共沉淀(co-IP)和比率双分子荧光互补(rBiFC)之间的相互作用。结果显示，AP5B和AP5M在烟草叶片中瞬时共表达时相互免疫共沉淀。同样，AP5M与SPG11和SPG15共免疫沉淀，而AP5B与SPG15共免疫沉淀。在rBiFC测定中，AP5M-nYFP (nYFP，YFP的N-末端片段)与AP5B-cYFP (cYFP，YFP的C-末端片段)和AP5Z-nYFP与AP5M-cYFP共表达，但不与AP5B-cYFP共表达，或AP3B-nYFP与AP5M-cYFP共表达导致烟草表皮细胞中的荧光恢复。这些数据证实了 AP-5亚基与 SPG 蛋白之间的相互作用（图二）。

图二、AP-5, AAK1, BAG4和P34蛋白相互作用网络的验证

进一步，研究人员检测了P34是否调节AP-1，AP-2和AP-4介导的运输途径，因为当 P34功能受损时，它们的丰度受到影响。P34-GFP主要定位于根细胞中的细胞质，并且与膜或细胞器不明显相关。实验表明，P34功能的损伤对AP-4稳定性有影响。总之，研究人员的数据表明，P34在一定程度上调节CME，但对液泡的运输和TGN/EE 蛋白子集的定位有更显着的影响，但对质外体的默认分泌没有影响。研究人员假设这些结果是通过维持正确的AP-1，AP-2和AP-4蛋白水平以及可能的复合组装来实现的。

综上所述，研究人员通过不同的蛋白质组学方法，在拟南芥中产生了五个AP和 TPLATE 复合物的整体相互作用组。相互作用组聚集在一些枢纽蛋白上，包括迄今为止未知的适应蛋白结合样蛋白（P34）。P34与网格蛋白相关的AP复合物相互作用，控制其稳定性，进而影响网格蛋白介导的内吞作用和高尔基体后的各种运输途径。总之，AP相互作用组网络为进一步发现植物细胞中未知的内膜运输调节因子提供了大量资源。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-022-01328-2

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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