以下文章来源于合成生物学与代谢工程实验室 ，作者蒋亦琪
摘要
浙江大学化学工程与生物工程学院林建平和连佳长课题组在Nature Communications发表了一篇研究论文“Manipulation of sterol homeostasis for the production of 24-epi-ergosterol in industrial yeast”，在酿酒酵母中实现了可用于油菜素内酯半合成的24-表-麦角甾醇的高效、可规模化制备。
油菜素内酯类化合物（Brassinosteroids，BRs），被认为是第六类植物激素，参与调节许多重要的植物生理活动，在提高作物的产量、品质、抗逆性（对外界不利环境的抵抗能力，如耐寒、耐盐、耐旱等）和抗病性等方面效果显著。在BRs中，油菜素内酯是最早发现的天然油菜素内酯类化合物，也是其中活性最高的化合物。然而，由于油菜素内酯在植物中含量很低，即便是在花粉中的含量也大多低于百万分之一，从中提取获得的油菜素内酯价比黄金。此外，由于缺少可以规模供应的前体物质或者成本太高，各种化学合成生产油菜素内酯的技术，经过全球科学家多年的努力，仍未能商业化应用。最终，产业界只能退而求其次，将其两种生物活性尚可的结构类似物（24-表-油菜素内酯和28-高-油菜素内酯）规模生产并应用于农业。
在了解到企业的技术需求后，通过对相关代谢途径和代谢物结构的分析和比较，团队推测植物来源的甾醇Δ24(28)还原酶（DWF1）可能具有催化麦角甾醇生物合成的前体24(28)-去氢麦角甾醇生成24-表-麦角甾醇的能力。一旦能够量产24-表-麦角甾醇，我们完全可以借助成熟的从麦角甾醇合成24-表-油菜素内酯的工艺，合成出油菜素内酯。幸运的是，初步的实验证实了我们的推断，尽管活性很低。随后，团队采用定向进化的方法，提高DWF1对24(28)-去氢麦角甾醇的催化活性，并进一步通过对甾醇的酰基化/水解平衡进行调控，实现酵母内目标产物积累量的提升。最后，通过高密度发酵，最终使工程酵母菌株发酵产24-表-麦角甾醇的效价达到2.76 g‧L-1。本工作为以接近24-表-油菜素内酯的价格向市场提供天然油菜素内酯奠定了基础。本研究采用的甾醇平衡工程策略也有望应用于其他经济功能重要的植物甾醇合成。
图1. 从头合成24-表-麦角甾醇酿酒酵母菌株的构建
引入植物来源的Δ24(28)-甾醇还原酶（DWF1），实现24-表-麦角甾醇的从头生物合成；随后，采用定向进化，增强DWF1的催化活性，提高24-表-麦角甾醇的合成能力；通过甾醇稳态的调控，即过表达YEH1、YEH2和ARE2，调控甾醇酰基化（储存游离甾醇于脂滴（Lipid Droplets，LDs）中）和甾醇酯水解（释放甾醇酯至细胞膜中）之间的平衡，加强甾醇流向24-表-麦角甾醇的通量，实现24-表-麦角甾醇的大量积累。
内容
1. 设计人工途径，实现酵母中24-表-麦角甾醇的从头合成
24-表-麦角甾醇，作为一种非天然甾醇，目前还没有以24(28)-去氢麦角甾醇（ergosta-5,7,22,24(28)-tetraene-3β-ol）为底物进行生物合成的相关报道，因此，设计人工生物合成途径成为可能的最佳选择（图1）。我们以手性催化的偏好性（甾醇Δ24(28)的还原）和底物结构的相似性（甾醇侧链）作为主要筛选标准，对植物甾醇生物合成途径的数据库进行了探索。通过比较酵母和植物中的甾醇生物合成途径，我们选择了植物来源的Δ24(28)-甾醇还原酶（Dimunito/Dwarf1，DWF1），一种分别催化C28-和C29- Δ24(28)-烯烃甾醇形成24-甲基和24-乙基胆甾醇的还原酶，用于构建24-表-麦角甾醇的人工合成途径（图2a）。在构建过程中，首先敲除酵母天然的编码Δ24(28)还原酶的ERG4；其次，分别引入来源于Arabidopsis thaliana （At）、Ajuga reptans （Ar）、Brassica rapa （Br）以及 Cannabis sativa （Cs）的DWF1，实现24-表-麦角甾醇的合成（图2b、图2c）；通过质谱分析（图2d）和核磁共振分析进一步证实合成产物为24-表-麦角甾醇。比较引入不同来源DWF1的重组酵母， YQE224（ArDWF1）的24-表-麦角甾醇产量较高（13.79 mg·L-1）（图2b），因此选择ArDWF1做后续的改造。但是，这样的发酵效价离商业应用仍然十分遥远，必须进一步改造关键酶，大幅度提高其对非天然底物的催化活性，此外，重构细胞内相关代谢途径以创建有利于目标产物积累的胞内环境也非常重要。
图2. 24-表-麦角甾醇合成途径的构建
2. 定向进化DWF1，增强24-表-麦角甾醇的合成
在初步验证24-表-麦角甾醇人工途径构建的可行性后，我们尝试通过蛋白质工程提高DWF1的催化能力。由于缺乏DWF1及其同源酶的晶体结构，定向进化提高DWF1催化活性成为首选，这就需要一个较为高效的高通量筛选方法。据报道，erg4Δ酵母菌株（缺乏麦角甾醇）表现出表型缺陷，如对十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）和潮霉素B（Hygromycin B，HygB）的敏感增强。考虑到结构的相似性，24-表-麦角甾醇可能会在一定程度上回补麦角甾醇的缺失，从而恢复表型缺陷。基于此，我们尝试利用DWF1活性与SDS和HygB胁迫条件下的细胞生长存在的可能联系来构建高通量筛选方法。为了验证高通量筛选方法的可行性，我们构建并比较了四株酵母菌株YQP1（BY4741携带pRS42H，能够高水平合成麦角甾醇，阳性对照）、YQP2（YQE101携带pRS42H，无麦角甾醇或24-表-麦角甾醇合成，阴性对照）、YQP3（YQE101携带pRS42H-AtDWF1，24-表-麦角甾醇的产量低）和YQP4（YQE101携带pRS42H-ArDWF1，24-表-麦角甾醇的产量略高）在添加100 μg·mL-1 HygB以及不同浓度SDS的YPD培养基中的生长情况。如图3a所示，YQP1在含有0.01% SDS的环境中，可以正常生长，而YQP2的生长在0.005%SDS的环境中则受到明显抑制，YQP4在0.005% 以及0.01% SDS的环境和生长状况比YQP3更佳，表明在同等的SDS和HygB胁迫条件下，DWF1活性（24-表-麦角甾醇含量）与细胞生长之间存在一定程度的正相关，同时，根据实验结果，选择添加0.025% SDS和100 μg·mL-1 HygB的YPD培养基作为高通量筛选培养基。通过易错PCR构建突变文库，结合高通量筛选，我们获得了六个阳性突变体（图3b），测序获知了10个单点突变；通过定点突变，对10个单点突变体进行活性验证（图3c）。由于发现所有的突变点都有利于ArDWF1活性的提高，而组合产生的组合突变体数量过大，因此我们进行了基于多重PCR的重组PCR方法（MUPREC）构建组合文库；使用相同的高筛方法，如图3d所示，我们获得了28个阳性组合突变体，其中，具有V143G、S306P和Y338H组合突变的突变体Ar207在维持极佳的立体选择性的基础上，展现出更高的ArDWF1活性和24-表-麦角甾醇产量。具有Ar207的酵母菌株YQE231能够合成46.72 mg·L-124-表-麦角甾醇，是对照菌株YQE224的3.46倍（图3d）。
图3. 蛋白质工程提高DWF1催化能力
3. 调控甾醇稳态，提高甾醇总量的积累
脂滴（Lipid Droplets，LDs）和细胞膜之间的甾醇稳态主要由两种甾醇酰基转移酶（ARE1和ARE2）和三种甾醇酯水解酶（YEH1、YEH2和TGL1）调节（图4a）。为了评估它们在甾醇代谢中起到的作用，我们对这五个基因ARE1、ARE2、YEH1、YEH2和TGL1分别进行了敲除或过表达操作。如图4b所示，尽管敲除ARE1或过表达ARE2、YEH1和YEH2都有利于24-表-麦角甾醇的生物合成，但单基因操作的优化效果相当有限，可能需要通过同时对甾醇酰基化（储存游离甾醇于LDs）和甾醇酯水解（释放LDs中的甾醇酯至细胞膜中）进行调控，重建甾醇稳态。正如预期，我们观察到了同时过表达酰基转移酶基因（ARE2）和水解酶基因（YEH1和/或YEH2）所产生的协同效应，在YPD培养基中，菌株YQE717（过表达ARE2、YEH1和YEH2）能够合成71.04 mg·L-1 24-表-麦角甾醇以及220.07 mg·L-1总晚期甾醇（具备Δ5,7的甾醇），比YQE231分别高1.65倍和2.09倍（图4b）。值得注意的是，引入额外拷贝的YEH1或YEH2均未能进一步增加24-表-麦角甾醇或总晚期甾醇的产量。尽管ARE1失活菌株（YQE722）在摇瓶中的24-表-麦角甾醇产量较高，但在高密度发酵过程中，特别是在乙醇补料阶段，ARE1的敲除对菌体生长以及产物积累产生了负面效果（图4c），发酵120 h后，YQE717的细胞密度达到186.05 gDCW·L-1 （g干细胞重量每升），而YQE722仅为153.36 gDCW·L-1。因此，受到细胞量的影响，YQE717发酵产24-表-麦角甾醇的效价更高，达到了2.15 g·L-1。此外，在前36 h，二者的24-表-麦角甾醇和总晚期甾醇的产量相当。36 h后， YQE231中的甾醇生物合成几乎停止，而YQE717继续积累总晚期甾醇和24-表-麦角甾醇。为验证甾醇酰基化-水解平衡与甾醇积累之间的关系，我们分别测定了YQE231和YQE717中ARE2、YEH1和YEH2的相对转录水平，结果表明，产物的积累与ARE2、YEH1和YEH2的基因表达量表现出一致的趋势。这些结果表明，24-表-麦角甾醇以及总晚期甾醇产量的增加归因于ARE2、YEH1和YEH2转录水平的提高，并由此带来的酵母中甾醇稳态的重建。
图4. 甾醇酰基化-水解动态平衡调控
4. 强化途径基因表达，提升24-表-麦角甾醇的产量以及纯度
尽管24-表-麦角甾醇的产量有了显著的提高，但24(28)-去氢麦角甾醇（DWF1的底物）以及其他前体甾醇也产生了明显的积累（图5b），这不仅降低了24-表-麦角甾醇的产量，而且增加了下游纯化的成本。为了实现更高比例24-表-麦角甾醇的合成，我们通过替换ArDWF1突变体（Ar207）的启动子提高表达水平，同时过表达编码乙酰辅酶A羧化酶的ACC1加强脂肪酸的生物合成，从而扩大24-表-麦角甾醇储存池，所得的菌株（YQE729）将24-表-麦角甾醇的产量增加到160.84 mg·L-1（图5a）。有趣的是，由PGAL1驱动的Ar207的表达导致了24-表-麦角甾醇生物合成途径中的另一种前体（24-表-麦角甾-5,7-二烯-3β-醇）的积累（图5a）。因此，我们构建了过表达ERG5（编码Δ22甾醇去饱和酶）的重组菌YQE734，以进一步提升24-表-麦角甾醇在晚期甾醇的比例（图5a）。最后，我们对YQE729和YQE734进行了高密度发酵测试，发酵结束时，YQE734的 24-表-麦角甾醇与晚期甾醇的比率高达84.2%；相反， YQE729的24-表-麦角甾醇与晚期甾醇的比率降至52.1%（图5b）。值得注意的是，YQE734的总晚期甾醇低于YQE729，这可能是由于ERG5的过表达导致的代谢负担（图5b）。总体而言，尽管YQE729和YQE734的24-表-麦角甾醇产量相近（约2.76 g·L-1），但目标产物在晚期甾醇中的高比例有利于降低下游的纯化成本（图5b），使得菌株YQE734更具工业应用前景。
图5. 代谢途径工程提高24-表-麦角甾醇的产量和纯度
总结
本研究在酿酒酵母中构建了一条人工设计的合成途径，实现了非天然甾醇——24-表-麦角甾醇的从头合成，同时，采用蛋白质工程以及甾醇稳态工程，提高24-表-麦角甾醇的产量，通过高密度发酵，实现了2.76 g·L-1 24-表-麦角甾醇的从头生物合成，为以接近24-表-油菜素内酯的价格向市场提供天然油菜素内酯奠定了基础。本研究采用的甾醇平衡工程策略也有望应用于其他植物甾醇的生物合成。
本研究得到了国家重点研发计划（2019YFA0905404）、浙江省自然科学基金（LR20B060003）和国家自然科学基金（22278361）等项目的支持。
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