华中农业大学农业曹罡/戴金霞开发新的方法，用于多种生物分子的多重原位检测

在生物学前所未有的单细胞测序和空间多组学时代，具有更高灵敏度和鲁棒性的荧光原位杂交(fluorescence In situ hybridization, FISH)技术，特别是用于检测短RNA和其他生物分子，受到了广泛的需求。

2023年1月27日，华中农业大学农业曹罡及戴金霞共同通讯在Nature Communications 在线发表题为“Highly efficient and robust π-FISH rainbow for multiplexed in situ detection of diverse biomolecules”的研究论文，该研究开发了一种高效、稳健的π-FISH Rainbow，用于多种生物分子的多重原位检测。

作者开发的这种方法，以单独或同时高效地检测不同的生物分子(DNA, RNA，蛋白质和神经递质)。这种方法被成功地应用于检测不同物种的基因表达，从微生物到植物和动物。此外，该研究仅通过两轮杂交就解码了21个标记基因的空间分布，描绘了不同神经元亚簇的景观。值得注意的是，作者将π-FISH Rainbow与杂交链式反应相结合，开发了患者循环肿瘤细胞中microRNA、前列腺癌抗雄激素治疗标记物ARV7剪接变异等核酸短片段π-FISH+技术。本研究为空间多组学研究和临床诊断提供了一种可靠的生物分子原位检测技术。

细胞功能多样性来源于复杂和组织良好的生物系统中的细胞异质性和各种微环境。在组织环境中确定细胞类型和分子特性对于破译单个细胞的独特功能特别不可或缺。大规模单细胞RNA测序(scRNA-seq)的出现极大地促进了多细胞生物细胞异质性的鉴定。但缺乏每个细胞簇的空间位置和周围组织微环境信息。FISH技术可以通过特异性杂交来解析核酸的空间位置，这在单细胞或单分子水平上对精确定位细胞亚型和空间分布关系产生了前所未有的见解。由于抗体的可用性和特异性远远落后于当前生物学研究中爆炸性增长的需求，因此，迫切需要新一代具有更高灵敏度、特异性、空间分辨率和鲁棒性的新一代尖端FISH技术，用于新一代生物学研究和临床诊断。

近年来，提高FISH信号强度的方法有杂交链式反应(HCR)、交换反应信号放大(SABER)、分支DNA (bDNA)放大、Amp FISH和滚动式循环放大(RCA)。高通量FISH方法，包括MERFISH, Seq FISH+和split-FISH，采用组合标记和顺序成像来可视化单个细胞中数百到数千个基因的表达。这些方法克服了在单细胞中检测RNA种类数量的限制，可以阐明原位基因表达谱的全面景观。尽管FISH方法取得了巨大进步，但新一代FISH技术仍处于起步阶段，有各种尚未解决的挑战需要进一步克服。因此，一种更高效、更准确的DNA、RNA和蛋白质的一步同步三重检测方法是迫切需要的。

π-FISH Rainbow的工作流程和探针序列信息（图源自Nature Communications ）

为了解决当前FISH技术面临的挑战，该研究开发了一种具有高强度信号和低背景噪声的高效复用π-FISH Rainbow方法。这种稳健的方法已应用于动物、植物和病原微生物的冷冻、石蜡和全装样品。此外，π-FISH Rainbow可以在单分子水平同时检测DNA、RNA和蛋白质。

值得注意的是，该研究进一步将π-FISH Rainbow与HCR结合，开发了π-FISH+技术，克服了短序列的检测限制。作者实现了microRNA、前列腺癌抗雄激素治疗耐药标记物ARV7剪接变异等核酸短片段的检测。总之，该研究为多种生物分子的原位检测提供了有力的工具，可广泛应用于各种生物学研究和临床诊断。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-36137-4

转自：“iNature”微信公众号

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