上海科技大学黄行许/南京大学刘江怀等合作开发具有更高精度的多功能核酸酶先导编辑器

基于核酸酶形式的先导编辑器(PEn)由于其复杂的编辑结果而受到限制。一种针对DNAPK的化学抑制剂介导非同源端连接(NHEJ)通路，最近被证明可以促进PEn的精确插入。然而，这种化学方法的特异性和内在毒性的问题限制了它的发展应用。

2023年1月19日，上海科技大学黄行许、南京大学刘江怀及浙江省实验室Zhu Shiqiang共同通讯在Nature Communications 在线发表题为“Development of a versatile nuclease prime editor with upgraded precision”的研究论文，该研究开发了一种具有更高精度的多功能核酸酶先导编辑器。该研究发现PEn和抑制nhej的53BP1-抑制性泛素变体的共同引入通过减轻意外编辑有效地驱动精确编辑，构建了一个高活性编辑平台(uPEn)，显然补充了典型PE。进一步的发展包括探索含同源区域的pegRNA (HR-pegRNA)的有效结构。

总的来说，uPEn可以在HEK293T细胞中高效地安装插入(38%)、删除(43%)和替换(52%)。与PE3/5max相比，uPEn在典型的顽固性碱基替换和小块编辑方面表现出更高的活性。综上所述，本工作建立了一个高效、具有广阔应用潜力的PE平台。

基于CRISPR-Cas系统的框架，以核酸酶、碱基编辑器和先导编辑器为形式的不同编辑工具已被用于纠正临床前模型中的致病变异。在这些工具中，最近开发的先导编辑(PE)技术是一个重大突破。PE平台采用一个由Cas9 nickase (H840A突变体，nCas9)/逆转录酶融合蛋白组成的先导编辑器，以及一个由传统sgRNA衍生的工程先导编辑引导RNA (pegRNA)。总的来说，PE可以进行广泛的遗传修饰，即碱基替换、小插入和删除，同时不需要供体DNA或双链断裂(DSB)。

最初的单切口依赖性PE平台称为PE2，而PE3平台需要添加第二链切口sgRNA，以促进反向转录编辑的安装。PE4/5平台的后期迭代利用PE2/3和错配修复抑制hMLH1dn的共同引入来提高编辑效率和纯度。各种替代的努力也被用来改进原来的PE2/3平台。然而，目前基于缺口酶的PE平台整体效率不理想且不稳定。

与基因组编辑相关的DNA损伤/修复的背景可能会强烈影响编辑结果。在这方面，PE的变体形式，即PE核酸酶(PEn)的出现是值得注意的。该平台集成了Cas9核酸酶生成的DSB和RT依赖性的3 '单链DNA (ssDNA)的合成，最初是为了绕过典型PE8中使用的第二个缺口sgRNA而开发的。PEn的初始应用有时会导致比PE3更高水平的精确编辑，以及不同编辑中间体的非同源端连接(NHEJ)修复引起的意外编辑的显著诱导。PEn工具还应用于具有互补RTT的双pegRNA，以用更短的设计序列替换较大的基因组区域。

尽管在某些应用程序上下文中具有潜在的实用功能，但此类原始版本的PEn需要进一步改进以减少意外编辑。最近，在操纵易出错的NHEJ以支持其他潜在的精确修复途径的假设下，Peterka等人将DNA-PK (AZD7648)的化学抑制剂与PEn16联合应用。研究发现，这大大减少了不精确的编辑，导致PEn16的精确插入相应增加。然而，关于化学抑制剂的特异性/毒性及其与细胞特异性或有条件给药的不相容性的不确定性，可能会限制这种改进的PEn方法的发展潜力。

uPEn的设计与优化（图源自Nature Communications ）

在传统基因组编辑的应用中，基于蛋白质或RNAi的关键修复因子的操纵也被采用来促进精确修复。对于一些修复因子，如肿瘤抑制p53结合蛋白1 (53BP1)，其刺激NHEJ作用的详细机制已经很好地建立起来。重要的是，良好的53BP1靶向蛋白工程方法已经被开发出来，并被证明可以增强传统的基因组编辑。

在这里，该研究探索了一个类似的策略来改善PEn。通过将PEn与53BP1-抑制性泛素变体相结合，该研究建立了一个平台(泛素变体辅助PEn, uPEn)，与PEn和典型PE平台相比，该平台在安装所需的RT依赖编辑方面的效率显著提高。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-35870-0

转自：“iNature”微信公众号

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