广山楂，又名芒山楂、大果山楂，为台湾林檎Malus doumeri (Bois.) Chev、光萼林檎M. leiocalyx S. Z. Huang的成熟果实，是广西道地药材之一[1-2]。广山楂的果实[3]、叶[4-5]均可入药，其果实性温，味甘、酸、涩，归脾、胃、肝经，具有消食健胃、行气散瘀的功效，用于肉食积滞、胃脘胀满、泻痢腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、心腹刺痛、疝气疼痛、高脂血症等[6]。现代药理研究表明广山楂具有开胃助消化、调血脂、消炎抗菌及抗肿瘤的作用[7]。其果大、气味清香、酸甜适中，为药食两用药[8]，现已列入广西壮药材质量标准[9]。
血瘀证模型包括气滞血瘀、气虚血瘀、外伤血瘀、血虚血瘀、寒凝血瘀、阳虚血瘀、阴虚血瘀、痰浊血瘀、热毒血瘀、慢性血瘀10种类型，不同血瘀模型所用造模方法不同[10]。广山楂具有行气散瘀之功效，现代药理表明其具有调血脂、治疗高血脂症等作用，故本研究采用高脂饲料喂养法建立痰浊血瘀模型，对广山楂的活血化瘀功效进行考察，采用HPLC建立广山楂指纹图谱，并运用数理统计方法将药效学信息与HPLC指纹图谱化学信息进行相关性研究，以期表征广山楂的活血化瘀效应组分，探寻广山楂活血化瘀活性成分的研究思路，为其谱效关系研究奠定基础[11]。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司，包括四元超高压溶剂系统、自动进样样本管理器、PDA检测器、Empower 2色谱工作站）；WND-200电热万能粉碎机（天津太斯特仪器有限公司）；SB25-12D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CPA225D万分之一分析天平 [赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；DZKW-D-6电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；JCS-W电子天平（哈尔滨众汇衡器有限公司）；C21-SC016-A电磁灶（杭州九阳生活电器有限公司）；N-1100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DLSB-5/20低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；NVP-1000隔膜真空泵、NVC-300真空控制器（上海爱朗仪器有限公司）；Microfuge 22R台式微量冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；FM40雪花制冰机（北京长流科学仪器公司）；AL800全自动生化仪（日本岛津）；Mill-Q Advantage超纯水系统（四川优普超纯科技有限公司）。
1.2 材料
对照品根皮苷（批号MUST-21071902，成都曼思特生物科技有限公司，质量分数≥99%）；绿原酸（批号MUST-21070910，成都曼思特生物科技有限公司，质量分数≥98%）；乙腈、甲醇（色谱级，美国飞世尔试剂公司）；血清总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒（批号20210722）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）试剂盒（批号20210721）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒（批号20210724）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）试剂盒（批号20210724）购自南京建成生物工程研究所；辛伐他丁（山东鲁抗医药集团赛特有限公司，批号30517）；甲醇、乙醇（分析级，成都科隆化学品有限公司）；磷酸（色谱级，成都金山化学试剂有限公司）；水为超纯水。18批不同产地广山楂药材经广西中药研究院黄云峰研究员鉴定为蔷薇科植物台湾林檎M. doumeri (Bois.) Chev的成熟果实。药材样品来源信息如表1所示。
1.3 动物
SPF级SD大鼠，6～8周，体质量160～200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号SCXK（湘）2019-0004）。动物实验经广西中医药大学伦理委员会批准（批准号为DW 2018），遵循广西中医药大学有关实验动物管理和使用的规定。动物于广西中医药大学动物中心常规喂养，自由进食饮水，10 h光照/14 h黑暗，温度21～25 ℃，湿度30%～70%。
2 方法
2.1 指纹图谱的建立
2.1.1 色谱条件 色谱柱为月旭BETASIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），洗脱梯度：0～3 min，6%～12% A；3～18 min，12% A；18～20 min，12%～19% A；20～45 min，19% A；45～53 min，19%～28% A；53～60 min，28%～30% A；60～78 min，30%～60% A。体积流量1 mL/min；柱温23 ℃；检测波长285 nm；进样量10 μL。
2.1.2 供试品溶液的制备 精密称定广山楂药材粉末（过65目筛）约1.0 g（精确至0.000 1 g），置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇20 mL，称定质量，超声1 h（500 W、50 Hz），取出晾凉，补足减失质量，过0.22 µm微孔滤膜，转移至进样瓶备用。
2.1.3 对照品溶液的制备 取适量绿原酸、根皮苷对照品，精密称定，分别加入甲醇定容于10 mL量瓶中，再分别吸取上述对照品溶液，配制为含绿原酸、根皮苷各0.05 mg/mL的混合对照品溶液。
2.1.4 方法学考察
（1）精密度：取广山楂药材（GSZG-1），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项色谱条件，连续进样6次，采集图谱，计算各共有峰峰面积及保留时间RSD值。
（2）重复性：取广山楂药材（GSZG-1），按照“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按照“2.1.1”项色谱条件，连续进样6次，采集图谱，计算各共有峰峰面积及保留时间RSD值。
（3）稳定性：取广山楂药材（GSZG-1），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h时进样，采集图谱，计算各共有峰峰面积及保留时间RSD值。
2.1.5 指纹图谱建立及相似度评价 取18批广山楂药材，采用“2.1.2”“2.1.3”项下方法进行溶液制备，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行数据分析。采用SPSS 23.0数据分析软件进行聚类分析。
2.2 活血化瘀药效研究
2.2.1 高脂饲料组成 2%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.5%胆酸钠、77.5%基础饲料。
2.2.2 广山楂药液的制备 10批广山楂果（GSZG-2、3、9、10、12、14～18，广山楂1～10）加10倍量水煎煮2 h，滤过后，药渣加8倍量水煎煮1.5 h，将2次滤液合并，浓缩至所需剂量，备用。
2.2.3 辛伐他汀药液的配制 将蒸馏水置于50～60 ℃水浴锅预热，甲基纤维素钠粉末与蒸馏水按5∶1水浴助溶；再将辛伐他汀白色药丸研磨成粉末状与0.5%甲基纤维素钠助悬剂按（1 mg∶1 mL）比例混合，于37 ℃水浴加热至完全溶解，配制成质量浓度为1 mg/mL的辛伐他汀药液。
2.2.4 活血化瘀实验 104只雄性SD大鼠适应性喂养7 d，按体质量随机分为对照组、模型组、阳性药（辛伐他汀）组、不同批次广山楂（广山楂1～10）组，每组8只。除对照组大鼠饲以常规饲料外，其余各组大鼠均饲以高脂饲料，每只大鼠投食量为25 g/d。不同批次广山楂组大鼠每天ig给药1次，给药剂量为10 g/kg，阳性药组每天ig给药1次，给药剂量为10 mg/kg，对照组和模型组大鼠每天ig等量水，连续给药5周。末次给药后，腹主动脉采血，离心（3000 r/min）15 min，取上清液，检测血液流变学指标及血脂四项指标TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。
2.3 谱效关系研究[12-14]
2.3.1 偏最小二乘回归（partial least-square method regression，PLSR）分析 利用SIMCA 14.1软件进行PLSR分析，以广山楂共有峰峰面积作为自变量（X），分别以给药组HDL-C、LDL-C、TC、TG含量作为因变量（Y1、Y2、Y3、Y4），进行相关性分析，建立回归方程。
2.3.2 灰色关联度分析 将10批广山楂共有峰分别与其血脂四项指标HDL-C、LDL-C、TC、TG含量相关联，计算关联度。
3 结果
3.1 HPLC指纹图谱
3.1.1 方法学考察 在重复性、精密度、稳定性考察中，以根皮苷为参照峰，样品各峰保留时间及峰面积RSD均小于3.0%，说明该法重复性、精密度及稳定性良好，可用于建立广山楂的指纹图谱。
3.1.2 色谱峰指认 以GSZG-1为参照图谱，进行多点校正和全谱峰匹配，生成广山楂指纹图谱及对照指纹图谱（R），见图1。根据相对保留时间（tR）及特征吸收波长，确定6个共有峰，并从6个共有峰中指认2个主要特征指纹峰即峰1、4，分别为绿原酸、根皮苷。以对照指纹图谱为参照，计算18批广山楂相似度，18批广山楂药材相似度值为0.200～1.000，与共有模式相似度在0.717～0.985。
3.1.3 聚类分析 将18批不同产地广山楂药材的6个共有峰的峰面积作为变量，导入SPSS 23.0数据分析软件，采用系统聚类分析法，将数据进行转换分析，得到广山楂药材的聚类分析图，如图2所示，以欧式距离15聚类，将18批广山楂分为3类，第1～15、17批分为第I类，第16批分为第II类、第18批分为第III类。
3.2 活血化瘀药效学结果
3.2.1 广山楂对大鼠血液流变学指标的影响 各组大鼠的血液流变学指标结果见表2。不同批次广山楂对大鼠血液流变学指数普遍影响较小，方差分析结果显示，与模型组比较，广山楂3、5组的全血低切还原黏度显著降低（P＜0.05），广山楂7～10组的红细胞聚集指数与红细胞聚集系数均显著降低（P＜0.01、0.001），其中广山楂8组的全血黏度（200/s）、全血黏度（30/s）与广山楂9组的全血黏度（200/s）明显升高（P＜0.05、0.01）。
3.2.2 广山楂对高血脂大鼠血脂四项的影响 各组大鼠的血脂四项指标见表3。方差分析结果显示，与模型组比较，除广山楂1、2组外，其余各组大鼠HDL-C含量均有不同程度增高（P＜0.05、0.01、0.001），但对大鼠LDL-C影响较小，仅广山楂1、3、4、8组大鼠LDL-C含量明显降低（P＜0.05、0.01）；各批次广山楂给药组大鼠TC显著降低（P＜0.01、0.001）；除广山楂3组外，各给药组大鼠TG均显著降低（P＜0.01、0.001）。由此可见，不同批次广山楂均具有不同程度的活血化瘀功效。
3.3 谱效关系研究结果[14-16]
3.3.1 PLSR方程 因变量Y1为HDL-C含量，建立方程为Y1＝−0.091 0 X1＋0.152 4 X2＋0.478 4 X3＋ 0.075 1 X4＋0.198 9 X5＋0.212 5 X6，其中2～6号色谱峰回归系数为正，即与HDL-C含量呈正相关，1号峰则呈负相关。因变量Y2为LDL-C含量，建立方程为Y2＝0.137 7 X1－0.521 9 X2－0.091 4 X3－0.111 6 X4＋0.546 0 X5＋0.149 8 X6，其中1、5、6号色谱峰回归系数为正，即与LDL-C呈正相关，其余各峰则呈负相关。因变量Y3为TC含量，建立方程为Y3＝0.241 0 X1－0.046 5 X2－0.202 5 X3－0.056 0 X4＋0.022 4 X5－0.184 1 X6，其中1、5号色谱峰回归系数为正，即与TC含量呈正相关，其余各峰则呈负相关。因变量Y4为TG含量，建立方程为Y4＝－0.118 1 X1－1.761 5 X2＋0.625 3 X3＋2.330 0 X4－0.847 9 X5－1.100 4 X6，其中3、4号色谱峰回归系数为正，即与TG含量呈正相关，其余各峰则呈负相关。
3.3.2 灰色关联度 采用均值法将10批广山楂的血脂四项数据与其共有峰峰面积数据进行归一化处理[15-16]。将归一化后的血脂四项指标设置为母序列Yk，6个共有峰归一化后峰面积设置为子序列为Xi（i表示共有峰编号1、2、3、4、5、6），然后计算母序列与子序列的灰色关联系数[Aik，Aik＝(Δikmin＋ρ×Δikmax)/(Δikmax＋ρ×Δikmax)]，其中Δik＝|Yk－Xi|，分辨系数ρ为0.5，Aik取平均值即关联度。当关联度大于0.8，则表示母序列与子序列关联度较大；当关联度介于0.6～0.8，则表示二者关联度一般；当关联度小于0.6，则表示二者关联度较小[17]。由表4可见，与广山楂血脂四项指标贡献作用关联度较大的色谱峰为3、5、6号色谱峰，说明其与广山楂活血化瘀作用关联性较大。与PLSR分析结果结合分析，可综合得出5、6号峰是与广山楂活血化瘀作用关联度较大的正相关色谱峰，即主要具有活血化瘀作用，该色谱峰所对应的物质成分还需进一步的探索研究。
4讨论
4.1 指纹图谱
本研究建立了广山楂药材的指纹图谱，根据《中药指纹图谱—质量评价、质量控制与新药研发》和《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南》，对流动相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈- 水、乙腈-0.1%磷酸水）进行考察，发现乙腈-0.1%磷酸水洗脱能力较好，色谱分离较好；采用紫外-可见分光光度计在200～400 nm波长下对广山楂药材样品进行扫描，285 nm波长下出峰数量较多；对柱温进行了考察，发现柱温在20～23 ℃时分离度良好，温度越高则分离度越差；对体积流量、不同酸浓度等耐用性进行了考察，体积流量在0.8～1.2 mL/min，酸浓度在0.8%～1.2%对色谱峰无明显影响。实验对提取方法及溶剂进行了考察，发现不同醇浓度色谱峰数量无差异，但醇浓度较低时提取不完全，导致色谱峰偏低，峰面积具有差异，最终将广山楂提取工艺定为70%甲醇超声提取。
4.2 药效研究
广山楂原植物多为山间野生，以广西靖西市多见，且山间生长环境复杂，导致不同产地药材具有差异性，所以实验最终选择广西山间多地采集的药材（GSZG-2、3、9、10、12、14～18批）进行药效学研究，发现不同批次药材对大鼠不同指标效果均有差异，与模型组相比，GSZG-15～18批广山楂对红细胞聚集指数及红细胞聚集系数具有显著性差异，10批药材均可以降低大鼠TC含量，其中9批可以降低TG含量，8批可以升高HDL-C含量。通过不同批次广山楂给药组血脂四项及血液流变学指标可以看出，广山楂对高血脂大鼠的血脂四项指标影响较为明显，但对血液流变学指标影响较小。不同批次广山楂对大鼠LDL-C影响较小，其中广西德保县孟达镇（GSZG-16）广山楂对大鼠血脂四项及血液流变学影响较大，由此可以看出不同产地广山楂有一定的药效差异。
4.3 谱效关系研究
主成分分析、典型相关分析、多元线性回归分析、灰色关联度分析、逐步回归分析、聚类分析、PLSR分析等为建立中药谱-效关系常用的统计学方法[18]，本研究采用的PLSR分析为较通用的方法。灰关联分析是灰色系统理论的一种新的分析方法，是根据因素之间发展趋势的相似或相异程度，亦即“灰色关联度”，作为衡量因素间关联程度的一种方法[18]。本研究采用PLSR和灰色关联度分析相结合的方法，成功建立了广山楂HPLC特征图谱与其抗高血脂的谱效关系，可以清晰地看出特征图谱中代表化学成分与广山楂“活血化瘀”药效的相关性，从而推测药效物质基础，综合得出5、6号峰是与活血化瘀作用关联性较大的色谱峰，即主要具有活血化瘀作用，其所代表的化学成分需要进一步探究。广山楂含有多种化学成分，其中1（绿原酸）、2、3、4（根皮苷）号色谱峰与其活血化瘀疗效同样具有相关性。广山楂活血化瘀作用并非仅由个别成分决定，而是多种成分的综合体现，其他成分的作用尚有待于进一步探究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：张 萌，邓家刚，韦 玮，郝二伟，秦健峰，谢金玲，覃豪丽，梁钰莹，覃竹慧，余良辰，侯小涛．广山楂HPLC指纹图谱建立及其活血化瘀作用谱效关系研究 [J]. 中草药, 2023, 54(2):601-607.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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