导读
本研究研究了干姜中的重要成分6-姜烯酚在饲喂高脂饮食（HFD）的C57BL/6J小鼠中改善肥胖的能力。在6-姜烯酚（20、40、60 mg/kg/2天）干预12周后，我们分析小鼠的肥胖相关指标、肠道微生物群和代谢组学。6-姜烯酚处理的小鼠肥胖程度和血脂水平降低，葡萄糖稳态改善，尤其是低剂量。6-姜烯酚的干预增加了肠道微生物群的多样性，降低了厚壁菌和拟杆菌的比例，也引起代谢组学的变化。低、中、高剂量6-姜烯酚分别有5、4和6种差异代谢物。其中，Solaculine、PE（22:5（4Z，7z，10z，13z，13z，16z）/14:1（9z））和前角鲨烯二磷酸盐与阿克曼氏菌、布鲁氏菌、Odoribacter和Mucispirillum有很强的相关性。本研究旨在为阐明6-姜烯酚改善肥胖的分子机制提供理论基础。
亮点：
1. 6-姜烯酚调节肠道菌群和代谢功能，改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖；
2. 6-姜烯酚调节肠道菌群结构，降低厚壁菌门与拟杆菌门的比值，促进改善肥胖相关有益菌群的增加；
3. Solaculine、PE（22:5（4Z，7z，10z，13z，13z，16z）/14:1（9z））和前角鲨烯二磷酸盐与阿克曼氏菌、布鲁氏菌、Odoribacter和Mucispirillum有较强的相关性。
论文ID
原名：Metabonomics and the gut microbiome analysis of the effect of 6-shogaol on improving obesity
译名：代谢组学和肠道微生物组学揭示干姜成分（6-姜烯酚）可缓解肥胖
期刊：Food Chemistry
IF：9.231
发表时间：2022.11
通讯作者：王硕&王向红
通讯作者单位：南开大学医学院&河北农业大学食品科技学院
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实验结果
1. 6-姜烯酚对体重、组织重量和Lee指数的影响
在12周的饮食干预后，我们可以清楚地观察到高脂饮食导致HFD和HFD-S（HFD饮食加吐温80）组的体重显著增加，lee’s指数增加（图1A–C）。剂量组的这些指标明显低于HFD组，但HFD-S组与HFD组之间没有显著差异，提示溶剂对体重变化没有影响，6-姜烯酚可以有效抑制体重增加，改善肥胖。与NC组相比，HFD显著增加了白色脂肪组织和肝脏的重量，而6-姜烯酚的干预改善了这一趋势，这与体重显著减轻的结论一致（图1D和E）。
图1（A）每周监测体重。（B）体重增加。（C）Lee指数。（D）白色脂肪组织重量（Epi-fat，附睾脂肪组织；Sub-fat，皮下脂肪组织；Mes-fat，肠系膜脂肪组织；Per-fat，肾周脂肪组织）。（E）肝组织重量。（F）OGTT期间的血糖水平。（G）OGTT期间血糖反应的曲线下面积（AUC）。（H）血清TG、TC、LDL-C和HDL-C含量。注：结果显示为（n=12）的平均值±SEM。与NC相比，#p＜0.05和##p＜0.01。与HFD相比，*p<0.05和**p<0.01。
2. 6-姜烯酚对糖耐量和血清生化的影响
我们进一步分析了口服葡萄糖耐量和血清生化指标。如图1F和G所示，我们绘制了口服葡萄糖耐量（OGTT）和AUC的曲线。结果表明，在整个过程中，HFD组的血糖反应超过NC（正常饮食）组，6-姜烯酚处理后OGTT的糖耐量得到改善。血清生化指标包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）。高脂饮食导致TG、TC和LDL-C水平显著升高，而HDL-C水平下降，如图1所示。6-姜烯酚的干预逆转了这一趋势，表明6-姜烯酚可以改善HFD引起的血液生化指标的变化。
图2 6-姜烯酚可减轻脂质积累和脂肪细胞增大
（A）肝脏和肝脏油红O染色。（B）肝脏脂滴面积的定量分析。（C）附睾脂肪及其HE染色。（D）脂肪细胞大小的定量分析。注：结果显示为（n=3）的平均值±SEM。与NC相比，#p＜0.05和##p＜0.01。与HFD相比，*p<0.05和**p<0.01。
3. 6-姜烯酚对肝脏和脂肪组织质量积累的影响
组织病理学结果如图2所示。高脂饮食导致肝组织中脂质积累增加，肝组织颜色变浅（图2A）。油红O可以将脂滴染成红色，如图2A和B所示，HFD组和HFD-S组的脂滴比例增加，6-姜烯酚改善了脂质的增加，这与肝脏重量的结果一致。脂肪细胞肥大与肥胖密切相关，因此我们计算了单个脂肪细胞的面积（图2C和D）。6-姜烯酚显著降低了HFD诱导的附睾脂肪细胞肥大，这与附睾脂组织重量的结果一致。
图3 6-姜烯酚调节肠道微生物群
（A）OUT水平的独特和共同细菌数量。（B）属水平NMDS分析。（C）门水平细菌组成（平均相对丰度>0.01%）。（D）各组门水平厚壁菌门和拟杆菌门的平均丰度。（E）不同组中厚壁菌与拟杆菌的比率。（F）属水平细菌组成（平均相对丰度>0.01%）。（G）分类单元之间的关系（从内环到外环，级别代表门、纲、目、科和属）。线性判别分析（LDA）评分。（H）源自LEfSe分析，显示生物标志物分类群LDA得分>2（条形长度代表LDA得分）。
4. 6-姜烯酚对肠道微生物群的影响
为了检查肠道微生物群，我们采集了结肠内容物样品，30个样品共产生1423016个高质量序列。其中，平均序列数为47434，平均长度为418 bp，最短序列长度为201 bp，最长序列长度为521 bp。我们通过稀疏曲线分析肠道微生物群样品（补充图1A），以比较不同物种的丰度和测序数据的合理性。补充图1B和1C研究了6-姜烯酚干预下细菌α多样性的变化。与NC组相比，HFD组肠道微生物群的chao指数和sobs指数下降，但6-姜烯酚干预可以改善这一趋势，低剂量6-姜烯酚（HFDL）和中剂量6-姜烯酚（HFDM）组显著增加。OTU水平上的独特和共享细菌的数量列于图3A。NC组有40种独特细菌，HFD组有6种，HFDL、HFDM和高剂量6-姜烯酚（HFDH）组分别有15种、2种和8种，表明HFD和6-姜烯酚改变了肠道微生物群。我们采用非度量多维尺度(NMDS)分析各组间的beta多样性(图3B)，结果表明在HFD和6-姜烯酚干预后，肠道菌群的组成发生了显著变化。NC组和HFD组易于区分，HFDL组和HFDM组与HFD组明显分离。然而，HFDH组的点相对离散，导致与HFD的分离不太明显。
通过物种组成分析，我们共鉴定出87属11门，其中厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、疣微菌门和Deferribacta是主要门（图3C和F）。根据我们的结果，HFD组的厚壁菌丰度显著高于NC组，而6-姜烯酚组与HFD组相比有不同程度的下降（图3D）。与HFD组相比，HFDL组的拟杆菌丰度增加。具体而言，HFD组厚壁菌与拟杆菌的比率（F/B）增加，6-姜烯酚干预后降低，但各组之间没有显著差异（图3E）。在属水平上，粪杆菌、Dubosiella、毛螺菌、乳酸菌、Coriobacteriaceae_UCG-002和阿克曼菌的丰度最高（图3F）。结果表明，HFD组与NC组相比，而HFDL、HFDM和HFDH组显著降低。因此，6-姜烯酚在一定程度上重新平衡了HFD引起的肠道微生物群的变化。此外，6-姜烯酚降低了Dubosiella的丰度，增加了Coriobacteraceae_UCG-002的丰度。
为了确定组间存在差异的特定细菌组，我们进行了Lefse（线性判别分析效应大小）分析，以2.0作为LDA（线性判别法）评分。Lefse检测到细菌从门到属的分支，并对微生物群进行了统计和相关分析，如图3G和H所示。HFD组中拟普雷沃菌属、无氧芽孢菌属和毛螺菌科富集。疣微菌、变形杆菌和Bacilli（包括阿克曼氏菌、Parasutterella、乳酸菌和肠球菌）在NC组中富集。6-姜烯酚干预后，一些改善肥胖相关的微生物群的丰度增加，如Coriobacteriaea_UCG-002、Rikenellaceae_RC9_gut_group、另枝菌、布劳特氏菌属、颤螺菌、毛螺菌科和罗氏菌属。
图4 各组间代谢物的聚类分析（PLS-DA评分图）
（A）HFD vs NC，正离子模式，R2X=0.366，R2Y=0.996，Q2=0.859；（B）HFD vs NC，负离子模式，R2X=0.376，R2Y=0.995，Q2=0.871；（C）HFDL vs HFD，正离子模式，R2X=0.34，R2Y=0.981，Q2=0.672；（D）HFDL vs HFD，负离子模式，R2X=0.312，R2Y=0.935，Q2=0.0507；（E）HFDM vs HFD，正离子模式，R2X=0.503，R2Y=0.998，Q2=0.926；（F）HFDM vs HFD，负离子模式，R2X=0.488，R2Y=0.994，Q2=0.828；（G）HFDH vs HFD，正离子模式，R2X=0.31，R2Y=0.994，Q2=0.822和（H）HFDH vs HFD，负离子模式，R2 X=0.45，R2Y=0.996，Q2=0.835。
5. 6-姜烯酚对代谢的影响
为了揭示6-姜烯酚诱导的代谢变化，我们分析了正常喂养、高脂肪喂养和6-姜烯酚处理的高脂肪喂养小鼠结肠内容物的代谢谱。我们在正离子模式和负离子模式下分别检测到7306和8024个质谱峰，共注释了1183和630个代谢物。通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA），肠代谢物因HFD和6-姜烯酚干预而显著不同。对照组和HFD联合6-姜烯酚干预组表现出明显的聚集性（补充图2）。比较两组，我们发现不同的饮食模式和6-姜烯酚的干预导致代谢物的差异，各组之间分别聚类（图4）。
与NC组相比，HFD组有6种不同的代谢物（P值<0.05，VIP值>2，FC值为1.5倍），其中，5,6-环氧、18r-hepe、柳杉二醇11-O-鼠李糖苷、3-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-N-[2-（4-羟基苯基）乙基]环氧乙烷-2-carboxamic acid被下调，而蜂斗菜醇酮、Pro-Gly-Lys-Ser、（R）-泛酸4′-o-b-d-葡萄糖苷被上调。与HFD组相比，HFDL、HFDM和HFDH组分别有5、4和6种不同的代谢物。常见的代谢物包括Solacauline、PE（22:5（4Z，7z，10z，13z，16Z）/14:1（9z））、前角鲨烯二磷酸盐（图5A–D，补充表2）。
图中所示的聚类分析热图显示了代谢物分布的差异（图5E）。与NC组相比，HFD组中的蜂斗菜醇酮、Pro-Gly-Lys-Ser、4-羟基苯甲酸葡糖醛酸、（R）-泛酸4′-o-b-d-葡糖醛酸减少，3-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-N-[2-（4-羟基苯基）乙基]环氧乙烷-2-carboxamic acid、5,6-环氧、18r-hepe和柳杉二醇11-O-鼠李糖苷增加。与HFD组相比，6-姜烯酚可逆转这些变化。
为了确定相关代谢途径，我们进行了KEGG分析（图5F-I）。NC和HFD组之间的主要代谢途径是鞘脂信号通路和磷脂酶D信号通路。HFD和HFDL的主要代谢途径是色氨酸代谢、吡啶代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及甘油磷脂代谢。HFD和HFDM的主要代谢途径是精氨酸生物合成、癌症中的中心碳代谢、牛磺酸和低血糖素代谢。HFD和HFDH的主要代谢途径是苯丙氨酸代谢、精氨酸生物合成。
图5 各组间不同代谢物和代谢途径的分析
（A）HFD与NC中差异代谢物的火山图。（B）HFDL与HFD。（C）HFDM与HFD的比较。（D）HFDH与HFD的比较。（E）结肠内容物代谢产物的层次聚类分析热图。（F–I）各组间KEGG途径富集分析。
6. 微生物和代谢组学结果的相关性分析
我们进一步分析了代谢物和微生物之间的相关性，如图5J所示。与NC组相比，HFD组差异代谢物中的蜂斗菜醇酮与Odoribacter和拟普雷沃菌呈正相关，与Family_XIII_AD3011_group呈正相关，与肠球菌、乳酸杆菌和阿克曼氏菌呈负相关。Pro-Gly-Lys-Ser与Anaerotruncus、Lachnoclostridium、布劳特氏菌和Mucispirillum呈正相关，与阿克曼菌呈负相关。3-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-N-[2-（4-羟基苯基）乙基]环氧乙烷-2-carboximidic acid与拟普雷沃菌、布劳特氏菌和Mucispirillum呈负相关，与肠球菌属和阿克曼菌属呈正相关。
与HFD组相比，干预组差异代谢物中的solacauline与脱硫弧菌呈正相关，与乳酸杆菌呈负相关。前角鲨烯二磷酸盐与Mucispirillum呈正相关，与乳酸杆菌呈负相关。PE（22:5（4Z，7z，10z，13z，16Z）/14:1（9z））与脱硫弧菌、Anaerotruncus、Coriobacteriaeae_Ucg-002和Mucispirillum呈正相关。5,6-环氧，18r-hepe与Anaerruncus，Lachnoclostridium，Enterhabdus和Mucispirillum呈负相关。（R）-3-羟基-十四烷酸与拟普雷沃菌、布劳特氏菌和Mucispirillum呈负相关，与肠球菌属和阿克曼菌属呈正相关。柳杉二醇11-鼠李糖苷与粪杆菌和肠杆菌呈负相关。5-乙基-2-甲基吡啶与拟普雷沃菌呈正相关。
讨论
脂肪组织和肝脏是参与肥胖发展的主要内分泌器官。肥胖引起的能量失衡导致脂肪细胞肥大和肝脏脂质沉积。在我们的研究中，为期12周的饮食干预结果表明，6-姜烯酚可以有效抑制HFD引起的肥胖。Lee指数是评估肥胖程度的有效指标。HFD增加了肥胖程度，6-姜烯酚显著改善了这一变化。同样，各组的体重、脂肪重量、肝脏重量和血脂指数也呈现出相似的趋势。在我们之前的研究中，6-姜烯酚可以抑制3T3L1前脂肪细胞的细胞分化、脂滴积累以及TG和TC的产生。这与本研究中6-姜烯酚降低小鼠脂肪重量的结果一致，表明6-姜烯酚可以通过阻止前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞来降低脂肪重量，从而改善肥胖。此外，HFD组和HFD-S组之间没有显著差异，这也证明了溶剂对减少小鼠肥胖没有影响。与8-姜烯酚和10-姜烯酚相比，6-姜烯酚具有更短的碳侧链和更好的降血糖活性。这项研究的OGTT结果表明，6-姜烯酚可以调节葡萄糖的稳定性。
如今，特别是在其成分和代谢物随肥胖演变而变化的过程中，肠道微生物群已被确定为决定肥胖和肥胖相关疾病发生和发展的重要因素。我们的研究结果表明，6-姜烯酚增加了肠道微生物群的多样性，改变了菌落结构，并促进了有益菌增加。研究表明，肥胖可能与两个主要细菌门有关：厚壁菌门和拟杆菌门。厚壁菌在肥胖患者中更为丰富，拟杆菌在瘦的患者中更丰富，而厚壁菌/拟杆菌比率的增加是肥胖患者肠道微生物群的一个重要特征。在这项工作中，6-姜烯酚显著降低了HFD引起的厚壁菌丰度增加，并降低了厚壁菌与拟杆菌的比例，表明6-姜烯酚对肠道微生物群的调节有助于减少HFD喂养引起的肥胖。
在属水平上，高脂肪饮食改变了相关细菌的丰度。在对肠道微生物群变化的研究中，我们发现它导致了优势细菌从拟杆菌和阿克曼菌转化为毛螺菌科和Muribaculaceae。我们的研究还发现，HFD组中毛螺菌的丰度增加，而阿克曼菌的丰度降低。我们进行Lefse分析以检查组间差异。在6-姜烯酚干预后，有益菌的丰度增加，如Coriobacteraceae_UCG-002、Rikenellacee_RC9_gut_group、另枝菌、布劳特氏菌、Oscillospiraries、Lachnopiracae_UCG-006和罗氏菌。人们认为，coriobacteria可能在许多生物宿主过程中发挥作用，包括葡萄糖稳态、胆汁酸和脂质代谢。研究表明，尽管肥胖小鼠的体重、血脂水平和肝脏甘油三酯水平降低，但Rikenellacee_RC9_gut_group丰度上调，提示Rikenellaceae_RC9_gut_group丰度的变化与肥胖有关。布劳特氏菌和另枝菌是SCFA（短链脂肪酸）的生产菌，另枝菌的相对丰度与HFD喂养小鼠的异常脂质代谢呈负相关。在心脑血管疾病的研究中，研究者们发现在血压、总胆固醇和甘油三酯降低的人群中，Lachnospiracae_UCG-006和Oscillospirales的丰度增加。在我们的研究中，6-姜烯酚干预后，Lachnospiracae_UCG-006和Oscillospirales增加，表明6-姜烯酚在降低甘油三酯和胆固醇方面具有积极意义。罗氏菌的低丰度可能影响许多代谢途径，并与许多疾病有关，如2型糖尿病、肥胖等。先前的研究发现，在体脂肪显著减少的受试者中，有益菌（如罗氏菌和Lachnospiraceae UCG-004）在属水平上显著增加，与我们的结果类似。
在这项研究中，对结肠内容物代谢谱的分析表明，饮食的变化导致了代谢变化。在差异代谢物分析中，Solacauline、PE（22:5（4Z、7z、10z、13z、16Z）/14:1（9z））和前角鲨烯二磷酸盐是三个干预组的常见差异代谢产物。它们都属于脂质和类脂分子，参与脂质代谢。KEGG分析表明，不同的代谢物参与了各组间的代谢途径。鞘脂信号通路与脂质代谢密切相关。在HFD的情况下，过量的脂质供应导致三酰甘油在肝脏中的积累增加，沉积的三酰甘油可以通过鞘脂途径酯化为神经酰胺，导致肥胖的加重。磷脂酶产生大量脂质产物并调控细胞内的信号转导。磷脂酶D家族参与蛋白质合成的磷脂代谢，可以调控内膜运输和肌动蛋白细胞骨架识别。因此，HFD引起的肥胖可能通过鞘脂信号通路和磷脂酶D信号通路实现。
此外，6-姜烯酚组和HFD组之间差异代谢物的代谢途径主要是氨基酸代谢、嘧啶代谢、糖磷脂代谢、牛磺酸和低血糖代谢等。肥胖和其他代谢问题受到人体胃肠道中微生物氨基酸代谢的影响。结肠细菌喜欢精氨酸、甘氨酸和BCAAs亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。这些氨基酸产生多种代谢副产物，包括氨、SCFA和支链脂肪酸。一些报告显示了色氨酸和组氨酸在调节能量平衡中的作用。色氨酸限制促进幼龄大鼠交感介导的能量消耗，这可能保护它们免受肥胖的影响。
Try的代谢途径由微生物群直接或间接调控。微生物群通过Trp转化产生的几种吲哚衍生物的促炎和氧化作用与动脉粥样硬化、动脉硬化和其他心血管并发症的发病机制有关。此外，微生物对氨基酸的代谢导致生物胺的产生，生物胺在体内具有深远的生理作用。例如，益生菌植物乳杆菌（将鸟氨酸脱羧生成腐胺）可以降低肥胖高血压患者的动脉血压和体重指数。这些肥胖者的尿腐胺水平明显较高，这与较高的乳酸杆菌丰度呈正相关。研究表明，肥胖和2型糖尿病患者的线粒体融合蛋白表达在衰老过程中减少，嘧啶代谢与线粒体密切相关。这种联系可以为治疗与线粒体功能障碍相关的疾病提供一种新的方法。几种代谢性疾病，包括肥胖、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝，都与糖脂代谢有关。
研究表明，Odoribacter负责产生鞘脂类化合物（即磺酸脂类），其在HFD组肠中丰度增加。这项研究还发现，Odoribacter与蜂斗菜醇酮呈正相关，是HFD的一种差异代谢物。阿克曼菌是肠道中的一种有益菌，具有多种健康益处。嗜黏蛋白阿克曼菌被认为是一种潜在的肥胖症作用菌。在之前的一项研究中，向动物注射嗜粘蛋白阿克曼菌可以有效抑制HFD喂养的肥胖小鼠的肥胖和改善代谢紊乱，并使HFD动物已受损的肠道结构和完整性恢复。本研究中代谢物与肠道微生物群的相关性分析表明，阿克曼菌与NC组和HFD组之间的差异代谢物具有很强的相关性。它与HFD组中显著增加的差异代谢物蜂斗菜醇酮和Pro-Gly-Lys-Ser呈负相关，与HFD中显著减少的3-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-N-[2-（4-羟基苯基）乙基]环氧乙烷-2-carboximidic呈正相关。（R）-3-羟基-十四酸是HFDH组中显著增加的代谢物，与HFD组相比，其与阿克曼菌的丰度呈正相关。胰岛素抵抗与布劳特氏菌密切相关。肥胖儿童肠道菌群中布劳特氏菌的丰度降低。B.luti丰度降低与肥胖相关，可能导致代谢性炎症和胰岛素抵抗。Mucispirillum与肠道炎症有关。Mucispirillum schaedleri通过干扰病原体侵袭机制表达从而对鼠伤寒沙门氏菌诱导的结肠炎具有保护作用。在HFD组中，Mucispirillum与显著增加的Pro-Gly-Lys-Ser呈正相关，与显著减少的3-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-N-[2-（4-羟基苯基）乙基]环氧乙烷-2-carboximidic呈负相关。在6-姜烯酚干预组中，Mucispirillum与显著增加的代谢物前角鲨烯二磷酸盐和PE呈正相关，而显著减少的代谢物5,6-环氧、18r-hepe、（R）-3-羟基十四酸呈负相关。此外，肠球菌和Lachnoclostridium也与炎症有关，这也与Mucispirillum有相似的相关性。这表明6-姜烯酚可能在改善HFD诱导的炎症中发挥积极作用。
结论
在这项研究中，我们证明了在饲喂给小鼠的HFD中补充6-姜烯酚可以改善肥胖，并调节肠道微生物群和代谢。具体而言，6-姜烯酚可以显著降低HFD小鼠的体重、肝脏脂质积累和脂肪细胞肥大，尤其是在低剂量时。此外，6-姜烯酚改善了葡萄糖稳态并调节了血脂水平。肠道微生物群和代谢组学的分析表明，6-姜烯酚调节了肠道微生物群的群落结构，并改变了代谢物水平的结构。因此，我们的研究为6-姜烯酚在改善肥胖中的作用提供了详细的见解，并阐明了其体内分子机制。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36327507/
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