基于代谢组学的特发性肺纤维化中医药研究思路与方法
刘妍彤1吕晓东1庞立健2臧凝子2刘勇明2张浩洋1
( 1辽宁中医药大学，沈阳 110847； 2辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032)
摘要：代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，其研究目的是明确机体生物学变化本质，通过现代谱学分析技术，对生物体内低分子量化学组分进行多维信息整合，具有融整体、动态、综合于一体的特点，广泛应用于中医药证候、复方等领域，为中医药的研究和发展提供了新的思路和平台。目前，中医药针对特发性肺纤维化的研究尚未形成系统的诊疗规范，本文基于代谢组学，从辨“病”“证”“方”“效”4个方面探讨特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）的研究思路及方法，意在形成基于代谢组学的IPF定量化、客观化、规范化的中医药研究思路与方法。
关键词: 代谢组学; 特发性肺纤维化; 思路与方法
基金：辽宁省“兴辽英才计划”高水平创新团队项目（XLYC1808011）-肺络病证治体系构建及应用创新团队； 辽宁省科技厅重点项目（2019JH2/10300023）-益气养阴活血通络法协调LncRNA-miRNA网络调控TGF-β1/Smads信号通路干预特发性肺纤维化的机制研究； 辽宁省教育厅科学研究项目（L202067）-基于肺络构效理论参龙煎剂干预IPF代谢组学研究；
Research Thinking and Methods of TCM on Idiopathic Pulmonary Fibrosis Based on Metabonomics
LIU Yantong1 ，LYU Xiaodong1 ，PANG Lijian2 ，ZANG Ningzi 2 ，LIU Yongming2 ，ZHANG Haoyang1
( 1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China; 2 The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China)
Abstract: As an important part of systems biology，metabolomics aims to clarify the nature of biological changes in the organism． Through modern spectral analysis technology，metabonomics can integrate multi-dimensional information of low molecular weight chemical components in organisms． It has the characteristics of integration，dynamic and comprehensive． And it is widely used in the fields of TCM syndromes，compound prescriptions and other fields，providing a new idea and platform for the research and development of TCM．At present，TCM research on idiopathic pulmonary fibrosis has not yet formed a systematic diagnosis and treatment standard． Based on metabolomics，this paper discusses the research thinking and methods of IPF from" disease" " syndrome" " compound" and " effect"，aiming to form a quantitative，objective and standardized TCM research thinking and method based on metabonomics．
Key words: Metabonomics; IPF; Thinking and methods
Fund: High-level Innovation Team Project of Liaoning Province "Xing Liao Yingcai Plan" (XLYC1808011)- Innovation Team for the Construction and Application of Pulmonary Collateral Disease Syndrome Treatment System; The key project of Liaoning Provincial Science and Technology Department (2019JH2/10300023)- Study on the mechanism of regulating TGF-β1/Smads signal pathway in idiopathic pulmonary fibrosis by coordinating LncRNA-miRNA network by supplementing qi, nourishing yin, activating blood and dredging collaterals; Scientific Research Project of Liaoning Provincial Department of Education (L202067)- Intervention of Shenlong Decoction on IPF metabonomics based on lung collaterals structure-activity theory;
特发性肺纤维化( idiopathic pulmonary fibrosis， IPF) 是一种病因尚不明确的进行性、纤维化性的慢性间质性肺疾病［1］，该病常起病隐匿，表现为进行性呼吸困难、厌食、消瘦、乏力，合并感染时可伴发热、急性干咳伴少量黄痰及血痰、Velcro 音，导致进行性低氧血症，最终因呼吸衰竭而致死，是现代医学面临的难题［2］。国内外调查研究显示，我国IPF平均发病年龄为66 岁，发病高峰在70至80 岁之间［3］。IPF患者确诊后生存率随时间推移显著下降，平均生存时间不足3. 5年，3年生存率为50%，5 年生存率仅为20%［4］。西医治疗包括支持性氧疗、肺康复训练、肺移植，药物治疗主要推荐吡非尼酮、 尼达尼布，然而上述药物靶点单一、可能存在不良反应事件［5］，同时药品价格昂贵。近年来，中医药在 IPF 的治疗方面进行了很多有益探索，能有效缓解临床症状，且不良反应少、价格低，寻求有效、安全的中医药治疗方法成为目前主要的研究目标。
代谢组学是通过机体终端的代谢产物来揭示生命活动最本质变化的一种现代科学分析方法，目前已经广泛应用于中医药方剂、病证等领域［6，7］。既往 IPF 证候学大多采用理论溯源结合经验分析的研究方法，近年来伴随着系统生物学的出现，定量化、客观化、规范化的研究方法陆续出现，对 IPF 的研究逐渐从理论向分子方向进一步延伸，本文意在进一步探讨基于代谢组学的 IPF 中医药研究思路及方法。
1代谢组学的研究内容
代谢组学( metabolomics) 是由英国 Nicholson 教授在1999 年提出的，建立在基因组学与蛋白质组学的基础上，主要研究生物体自身代谢产物种类、数量及变化规律，分析生物系统表达的一门新兴组织学科，是系统生物学的重要组成部分［8］。代谢组学以研究对象的体液( 主要是血液和尿液)为样本［9］，用液质联用、气质联用、核磁共振、毛细管电泳-质谱等现代分离技术进行分析［10］。通过以上技术对得到的原始数据进行逐层分析处理，通过追踪代谢标记物找到其中潜在的靶点信息，再通过富集分析等手段进一步找出代谢的通路及途径，发掘其生物学过程及意义［11］。代谢组学对最终代谢产物进行分析研究，找出有代表性的标记物，从代谢途径来追溯更深层次的病理机制及病理生理改变，能够更加直观地展现机体代谢的状态，将抽象的理化指标以更加整体性、客观性的方式进行展现，有利于对复杂性整体进行全面的分析认知。其应用范围包括研究基因的解析、疾病病理的阐述、药物的设计与研发、疾病标志物的筛选和疾病的诊断及治疗效果的预测等，对于探究疾病发生发展的生理变化和病理改变有着重要意义，亦有助于发掘后续的治疗手段和方法。
2 将代谢组学引入中医药研究中的意义
随着近年来系统生物学的不断发展，中医学复杂理论体系的价值及内涵逐步得到完善。作为后基因时代的新兴技术手段，代谢组学强调通过对人体体液中的组成成分变化进行分析，以反映机体代谢网络的整体变化规律，其精髓在于构建生物体系中分子族之间的相互作用网络，具有融整体、动态、整合分析的特点［12］。中医学“证候”体现的是人体疾病某一阶段脏腑经络阴阳、气血津液输布的动态变化以及与外界环境的交互作用，是全身功能关系失调的外在表现，涉及人体多系统、多层面的物质变化，辨证的过程是从机体宏观的外在表象来观察生命活动和疾病变化过程。因此应用代谢组学来研究疾病的发生发展具有“整体性”和“系统性”的特点，与中医的整体思维不谋而合，两者在方法论原理上具有统一性，为中医诊疗疾病提供了新的研究思路与平台。
3 基于代谢组学 IPF 中医药研究思路与方法———病、证、方、效
3.1 辨“病”应包括宏观证候与微观病理基础
疾病的发生发展模式是一种动态的演变过程， IPF 患者表现于外的宏观证候与表现于内的微观病 理基础是导致多系统疾病产生的关键环节。IPF 在疾病的不同阶段表现出不同的病理表现以及临床特征，故不同阶段的 IPF 可在代谢产物方面显示出差异性。因此基于代谢组学，从 IPF 代谢网络终端的整体角度探索生物体液、组织中内源性代谢产物的变化，对 IPF 的代谢特点进行多层次、多靶点的整合分析，有助于体现出 IPF 下的整体状态以及生物体产生的整体效应，对 IPF 进行辨“病”分析。研究表明，肺纤维化代谢通路以神经酰胺酶、磷脂酶为代表的鞘磷脂类代谢为主，神经酰胺酶、磷脂酶类代谢通路的差异性是肺纤维化炎症等症状存在的基础，也是参与肺纤维化疾病发展过程中的主要通路所在［13］。ZHAO 等［14］应用质谱法检测 8 例 IPF 患者和 8 例健康受试者的肺组织，发现与对照组比较， IPF 组存在鞘脂、精氨酸、能量代谢、血红素和谷氨酸/天冬氨酸代谢的信号通路改变，反映了 IPF 存在能量代谢紊乱、细胞外基质沉积、细胞增殖增加、肺结构重塑及氧化应激增加，该研究可从代谢组学角度解读 IPF 的发病机制。
因此在 IPF 的中医诊疗中，从宏观层面调节脏腑、平衡阴阳的同时，还应注意对微观损伤的缓解作用，其中包括疾病状态下的病理学基础以及分子层面的生物学信息。
3. 2 辨“证”意在建立证型的客观化判别标准
证是中医学对疾病发展到某一阶段时机体整体状态的概括，是受机体内因与环境外因综合作用的结果。中医学的核心理念是从系统全面的角度，以整体动态的观念对疾病进行辨证论治，这与代谢组学全面性、系统性的作用原理具有一致性。因此，将代谢组学引入中医证候学的研究中，其评价具有整体性和客观性。
目前代谢组学已经应用于多种疾病的证型研究之中，证明了代谢组学研究手段在揭示中医临床证本质研究中的可行性［15］。简维雄等［16］基于代谢组学探讨心血瘀阻证的动态演变过程，提示血瘀证不同时期分别存在脂质代谢紊乱、尿素循环紊乱以及糖代谢障碍。徐舒等［17］运用氢核磁共振 ( 1 H nuclear magnetic resonance，1 H NMＲ) 技术，发现“肝郁证”状态下的代谢生物群，以此阐释肝郁证的本质。朱萱萱等［18］基于气相层析飞行时间式质谱术 ( gas chromatography tandem time-of flight mass spectrometry，GC-TOF-MS) ，对气虚血瘀型和痰阻心脉型进行区分。
总之，通过建立数据模型，从大量来自不同个体的样本信息中得到同一证型的共同代谢指标，即可作为客观化的评判标准; 对偏离出正常范围的特征性代谢表达图谱，则判定为多维多息图谱的形式在代谢物表达上的客观反映，即不同证候的差异性物质基础，这为日后研究中医证候及其生物学本质提供了坚实基础。通过代谢组学的研究手段，发现 IPF 不同证候之间的差异性代谢产物，推测出与之有关的代谢途径，即可建立 IPF 不同证候识别模式的客观化及量化的依据。
3. 3 辨“方”意在阐明药效基础及有效性机制
中药方剂成分多样、靶点不一以及给药形式的特殊性、方证对应的专属性，决定了其药效物质基础鉴别的复杂性。因此，寻求一种可靠、客观的研究手段是中药复方研究的首要任务。代谢组学作为系统生物学的一个新兴学科，可以从终端反映生命的整体信息，被认为是挖掘药效物质基础、阐明作用机制的有效办法。目前，代谢组学在中药复方作用机制以及物质基础的研究中得到了广泛的应用［19］。王喜军［20，21］ 创建并建立了中医方证代谢组学 “Chinmedomics”，为基于代谢组学的 IPF 辨“方”提供了导向作用，提示通过血清学代谢产物的变化反映出方剂作用的物质基础。Yang B［22］、Wang XJ［23］、耿放［24］等分别利用代谢组学方法，探讨酸枣仁汤防治失眠、温心方治疗心肌缺血、逍遥散治疗急性肝损伤的作用机制以及药效物质基础，主要涉及糖酵解、脂肪酸代谢、氨基酸代谢等代谢途径。
以上结果表明，代谢组学能客观地反映中药方剂作用于人体后机体产生的生物学指标，进而对其产生的生物学过程进行客观化反映。将其作为药物的有效性、安全性的物质基础及疗效判定指标，是一种具有系统性、整体性的研究方法。因此，在中药方剂临床应用有效性的前提下，将证候对应的内源性生物标记物与外源性方剂有效成分相关联，能够说明方剂的药效物质基础，阐明效性机制，揭示方剂配伍规律及其科学内涵。
3. 4 辨“效”意在寻找 IPF 治疗效果的客观化反应
目前，已有一定研究将代谢组学引入 IPF 生物 标志物的研究当中。研究显示，应用超高效液相色谱联合高分辨率质谱的方法，显示溶血磷脂酰胆碱 ( Lyso PC) 可以作为 IPF 患者血清中的潜在生物标志物［25］。呼出气冷凝液( exhaled breath condensate， EBC) 由于浓度低和方法学限制，分析潜在的生物标志物很困难。通过使用非靶向代谢组学方法，可以有效识别 IPF 患者以及健康对照组的差异性代谢谱［26］。Montesi SB 等［27］通过液相色谱-质谱联用技术分析了 11 个肺纤维化患者的血浆和呼出气冷凝液脂质组学，在 EBC 中鉴定 出9种溶血卵磷脂 ( lysophosphatidylcholine，LPC ) ，其中溶血磷脂酸 ( lysophosphatidic acid，LPA) 显著升高，被认为是肺纤维化进展的生物标记物。1 项研究纳入 22 例未接受治疗的 IPF 患者和 18 例健康受试者的血液样本，经超高效液相色谱结合质谱检测，提示 2 组之间存在 62 种差异脂质，其中 6 种( Ｒ7、Ｒ9、Ｒ13、Ｒ16、 Ｒ17 和 Ｒ21) 可作为潜在的生物标志物，经接受者操作特性曲线( receiver operating characteristic curve， ＲOC) 分析可区分 IPF 患者与健康人群［28］。亦有研究显示，在 IPF 肺组织中乳酸代谢增加［29］。在 IPF呼出的气体中，氨基酸水平增加［30］，两者皆可被用做 IPF 的生物标志物。
因此，脂质、溶血磷脂酰胆碱、乳酸以及氨基酸是目前经代谢组学研究出 IPF 的几种生物标志物。基于此方法可对 IPF 的其余生物标志物进一步发掘探讨，同时这些代谢标志物可作为 IPF 治疗效果的客观化判定指标。
4 结语
综上，代谢组学以系统方法研究为模式，切合中医理论中的整体观念，切合中药多成分、多靶点协同作用的特点，是实现 IPF 中医药研究科学化、客观化和规范标准化的重要方法。通过代谢产物的整合与分析，能更加直观地反映 IPF 状态下分子层面的内在表现，帮助“辨病”; 了解 IPF 不同证候下的差异代谢谱，掌握不同证候下的客观化判别指标，帮助 “辨证”; 掌握方剂在体内的化学成分变化，探寻方剂的作用机制和药效物质基础，帮助“辨方”; 寻找筛查出药物或临床相关的生物标记物，从微观角度对机体的整体信息进行全面解读，帮助“辨效”，形 成 IPF 辨“病”“证”“方”“效”诊疗模式，最终形成基于代谢组学的 IPF 中医药研究思路与方法。并基于此模式，对其他疾病的中医药诊疗思路进行研究及探讨，一方面可以丰富中医理论的科学内涵，另一方面可以促进中西医的有效结合，促进中医药的现代化、国际化，让系统生物学成为中医走向国际化的通用语言。
转自：“如沐风科研”微信公众号
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