补骨脂，又名破故纸，为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实[1]，具有补肾助阳、纳气平喘、温脾健胃止泻等功效[2]。研究表明，补骨脂具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒[3-6]等多种药理活性，可用来治疗白癜风、骨质疏松、银屑病[7-10]等，具有广泛的药理作用。随着补骨脂越来越多的应用于临床，其不良反应与毒性也逐渐显露，近年来有大量研究相继报道补骨脂在长时间、常规剂量或大剂量使用时均会引起不良反应的发生，如肝脏毒性[11-12]、生殖毒性[13]、肾脏毒性[14]、光敏反应毒性[15]等。其中，肝脏毒性是补骨脂的主要不良反应[16-20]。
中药肝毒性已成为热点问题，但针对其研究大多借助化学药的毒性研究方法，往往忽视了中医基础理论的重要性，忽视了机体病证状态与中药毒性之间的关联性。早在《黄帝内经·素问》中就有提到“有故无殒”理论[21-22]，原文强调妊娠病不需拘泥于各种妊娠禁忌，而应根据具体的病情辨证施治[23]，后世医家将该理论用于除妊娠病外其他疾病的指导，也可作为体虚及老幼人群使用峻猛药的理论依据[24]，现又被用于中药毒性研究，如何首乌[25]、雷公藤[26]、淫羊藿[27]和细辛[28-30]等，提出不能就病症或药物单方面的评价中药的毒性，而应该综合考虑两者之间的密切联系。历代医家认为补骨脂适用于阳虚证，而阴虚者需忌服，补骨脂的肝毒性与证候关系密切，因而中药毒性研究应从中医辨证论治角度来诠释中药毒性内涵，以更为科学地明确毒性诱因。
本课题组前期采用蛋白质组学结合代谢组学技术，发现补骨脂在正常大鼠中的肝毒性潜在机制与调控胆汁酸代谢、能量代谢和免疫系统等相关代谢途径有关[31]，而补骨脂肝毒性与肾虚证候的关联性尚未见报道。本研究拟从中医证候角度探讨补骨脂对不同肾虚证模型大鼠肝脏功能的影响，基于“有故无殒”理论辨证地诠释传统“无毒”中药的毒性内涵，为正确评价补骨脂毒性提供新思路，为临床合理应用提供参考。
1材料
1.1动物
SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，6周龄，购自北京华阜生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（粤）2018-0002。动物饲养于天津中医药大学动物中心，温度（23±2）℃，相对湿度（45±5）%，12 h昼夜更替，自由进食饮水，适应性饲养1周后开始实验。动物实验经天津中医药大学动物伦理委员会批准（批准号TCM-LAEC2022075）。
1.2 药材
补骨脂（产地河南，批号20211203）购自北京同仁堂天津平山道大药房有限公司，经天津中医药大学胡静副教授鉴定为豆科植物补骨脂P. corylifolia L.的干燥成熟果实。
1.3 药品与试剂
氢化可的松注射液（批号2201221）购自国药集团容生制药有限公司；甲状腺素片（批号210102）购自山东惠诺制药有限公司；利血平注射液（批号2006041）购自天津金耀药业有限公司；纯净水购自广州屈臣氏公司；生理盐水购自山东齐都药业有限公司；4%多聚甲醛购自Hiosherp公司；睾酮（testosterone，T）、甲状腺素（thyroxine，T4）ELISA试剂盒（批号YT003298、YT003304）购自天津伊特生命科学研发有限公司。
1.4 仪器
H1750R型离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；RE-52型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Rt2100c型酶标仪（美国Rayto公司），Microlab 300型全自动生化分析仪（荷兰Vital公司）；Eclipse CI型正置光学显微镜（日本Nikon公司）。
2 方法
2.1 动物造模与分组
将SD大鼠随机分为3组，包括空白组（6只）、肾阳虚组（18只）、肾阴虚组（18只）。空白组大鼠每天ig生理盐水（10 mL/kg），连续10 d；肾阳虚组每天ip氢化可的松注射液（10 mg/kg），连续15 d，复制肾阳虚大鼠模型；肾阴虚组每天ig甲状腺素（80 mg/kg）和利血平（0.5 mg/kg）的混合液，连续10 d以复制肾阴虚大鼠模型。在最后一次给药后于眼后静脉丛采血，4 ℃、3000 r/min离心15 min，分离血清后置于−80 ℃冰箱中用于指标检测。
2.2 补骨脂水煎液的制备
称取补骨脂药材，分别加入10倍量、8倍量纯净水，各煎煮1 h，滤过，合并滤液并浓缩至1.3 g/mL（相当于生药量）即得高剂量补骨脂水煎液，将其稀释5倍后至0.26 g/mL即得低剂量补骨脂水煎液，于4 ℃冰箱保存备用。补骨脂水煎液经高效液相色谱法检测，含补骨脂素1.07 mg/g、异补骨脂素0.75 mg/g、补骨脂酚1.76 mg/g。
2.3 分组与给药
肾阳虚组大鼠分为3组，每组6只，即肾阳虚组、肾阳虚＋补骨脂低剂量组和肾阳虚＋补骨脂高剂量组；肾阴虚组大鼠分为3组，每组6只，即肾阴虚组、肾阴虚＋补骨脂低剂量组和肾阴虚＋补骨脂高剂量组。空白组、肾阳虚组和肾阴虚组大鼠ig生理盐水（10 mL/kg），补骨脂低剂量组ig补骨脂水煎液1.05 g/kg（临床等效剂量），补骨脂高剂量组ig补骨脂水煎液5.25 g/kg（临床等效剂量的5倍）。注意观察大鼠的一般行为并记录，连续给药15 d后禁食12 h，于第16天腹主动脉采集全血，第1次在4 ℃、3000 r/min离心15 min，取上清液，第2次于4 ℃、3500 r/min离心8 min，取上清，将其分装于离心管中并保存至−80 ℃冰箱中，用于生化指标及脂质组学检测。采血完成后，取大鼠肝脏组织，放入冻存管中并转至液氮中冷冻，最后将样本保存至−80 ℃冰箱中。同时，各组随机选取2只大鼠，用生理盐水处理其肝脏血渍后用滤纸吸干，浸泡于4%甲醛溶液中保存，用于组织病理学观察。
2.4指标检测
2.4.1 一般行为学观察 根据《中医虚证辨证参考标准》中对肾阳虚、肾阴虚证候的诊断标准，观察肾阳虚组和肾阴虚组大鼠的精神状态、活动频率、毛发色泽度、饮水进食量、大小便、体质量等行为学变化。判断大鼠不同证候现象是否与临床表现相符合，以此作为判断模型建立成功的依据。
2.4.2 模型指标检测 取大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书对T、T4含量进行测定。
2.4.3 生化指标检测 采用全自动生化仪测定大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、白蛋白（albumin，ALB）和总蛋白（total protein，TP）的含量变化。
2.4.4 组织病理学检测 采用苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠肝组织情况，石蜡切片（5 μm）用二甲苯脱蜡，经过水合后苏木素染色10 min，再通过分化、染色、脱水、二甲苯透明、中性树脂胶封等步骤，最后于光学显微镜下观察大鼠肝组织的病理形态，并进行组织学评价。
2.5统计学分析
使用Graphpad Prism 8.0软件处理数椐，组间两两比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。
3 结果
3.1大鼠一般行为学考察
空白组大鼠饮水进食量稳定，大小便正常，活动自如，体毛润泽；肾阳虚组大鼠在造模期间出现畏寒倦缩、喜扎堆、反应迟钝、饮水减少、活动减少、体毛失去光泽、发黄并出现稀疏，尿量增多等现象，与肾阳虚证状态相吻合；肾阴虚组大鼠在造模期间出现饮水量和进食量略增多，部分大鼠大便干结，明显地易激怒，不易抓取等现象，与肾阴虚证状态相吻合。
3.2大鼠血清T和T4含量的测定
如图1所示，与空白组比较，肾阳虚组大鼠血清T和T4含量均显著降低（P＜0.05），表明大鼠呈现典型的肾阳虚病理特征；肾阴虚组大鼠血清中T和T4含量均显著升高（P＜0.05、0.01），表明大鼠呈现典型的肾阴虚病理特征。
3.3大鼠生化指标检测
如图2所示，与空白组比较，肾阳虚组大鼠血清ALT、ALP活性及TG水平显著升高（P＜0.05、0.01、0.001），TC有上升趋势，ALB显著下降（P＜0.001），TP有下降趋势，提示氢化可的松可能会引起肾阳虚大鼠出现肝细胞损伤；给予补骨脂水煎液后，与肾阳虚组比较，补骨脂低剂量组和高剂量组ALT和AST活性均有下降趋势，且逐渐趋于空白组，TP有上升趋势，ALP活性及TG水平显著下降（P＜0.01、0.001），补骨脂低剂量组ALB显著上升（P＜0.05）。由此可知，补骨脂水煎液不会对肾阳虚大鼠造成肝脏损伤。
如图3所示，与空白组比较，肾阴虚组大鼠血清ALT、AST、ALP活性及TC、TG、ALB和TP的含量均无显著性变化，表明甲状腺素＋利血平造模药物本身不会造成大鼠肝损伤。给予补骨脂水煎液后，与空白组比较，补骨脂低剂量组和高剂量组ALT、AST活性均显著升高（P＜0.05、0.01），ALB和TP均显著降低（P＜0.01、0.001），补骨脂低剂量组TC水平显著升高（P＜0.05）。与肾阴虚组比较，补骨脂低剂量组和高剂量组AST活性显著升高（P＜0.05），ALB显著降低（P＜0.05、0.01），补骨脂高剂量组ALT活性显著升高（P＜0.01），TP显著降低（P＜0.05）。由结果可知，肾阴虚证模型大鼠给予补骨脂水煎液后，可能会对大鼠肝脏造成一定的损伤，且随着剂量的增加肝损伤程度不断加重。
3.4 大鼠肝脏病理形态学检查
如图4所示，与空白组比较，肾阳虚组肝脏组织局部少量肝细胞坏死，出现炎性细胞浸润；与肾阳虚组比较，补骨脂低、高剂量组肝小叶结构清晰，肝细胞胞质形态结构正常，肝细胞坏死和炎性细胞浸润均有不同程度减轻。由此可见，给药补骨脂后大鼠肝损伤程度减弱，结构趋于正常。
与空白组比较，肾阴虚组未见明显异常改变；与肾阴虚组比较，补骨脂低剂量组肝组织局部少量肝细胞坏死，胞核固缩深染或碎裂溶解，细胞分界不清；补骨脂高剂量组肝板排列出现紊乱，汇管区胆管周围多见炎性细胞浸润。结果表明，补骨脂引起肾阴虚组大鼠肝脏病变。
4 讨论
4.1 “辨证论治”理论对中药药效或毒性研究的重要性
以往补骨脂的药理毒理研究，多数从药效和毒性2方面进行。研究表明，补骨脂酚通过促进成肌纤维细胞凋亡来抑制肝纤维化，并通过抑制氧化应激和炎症变化来减轻多种有毒物质的肝毒性[32-34]。传统中医理论认为，毒性也是中药药性中不可或缺的一部分，毒性即药物的偏性，当患者病证状态与其偏性相符时，则产生治疗作用；而病证状态与患者偏性不符时，就会使机体阴阳失衡，从而导致不良反应的发生[35]。因此，秉承“辨证论治”的理论思想在中药临床应用时极为重要。许多中药均规定适宜证候及不宜证候，如菟丝子能补肾养肝，温补其下，乃温脾助胃之药也[36]；补骨脂为暖水脏，阴中生阳，则为壮火益土之要药也[37]。凡病阴虚火动，皆不宜服；淫羊藿性温而辛、补肾壮阳，适用于真阳不足者，阴虚而相火易动者应忌之[38]；何首乌可用于肝肾阴虚者或为精血亏虚证者，而不可用于肾阳虚证患者，否则可能导致肝损伤[39]。因此，中药的毒性研究，需根据临床具体辨证情况用药，不能脱离病证而孤立研究。
4.2 补骨脂“药证不符”对大鼠肝功能的影响
ALT和AST是反映机体肝功能的2个重要指标[40-41]。ALT主要分布于肝细胞质中[42]，而AST大部分位于线粒体内[43]。当机体肝细胞坏死或损伤时，血清生化指标ALT活性升高，ALT被认为是反映肝损伤灵敏度最高的指标[44]。正常情况下，机体内AST活性很低，当神经胶质细胞受损时，血液中AST活性会升高。因此，相比之下，AST的敏感程度不如ALT[45]，只有当肝细胞发生实质性不可逆损伤时，血清中AST活性才会升高[46]。ALP为磷酸单酯酶，当肝脏损伤时ALP活性会升高，也可作为临床判断肝损伤的依据[47-48]。TG水平能够反映脂肪在肝细胞的沉积情况，TC过高是一种血脂过度升高的表现，血脂增高会导致肝细胞的破坏而引起肝功能异常[49]。ALB为血浆蛋白成分之一，当白蛋白含量偏低时，往往就提示着肝脏受到了损害，其含量越低，表明肝脏受损程度越严重[50]。血清TP主要由肝脏合成，肝损伤时会使蛋白质合成发生障碍，造成TP含量减少[51]。从结果可以看出，与空白组比较，肾阳虚组大鼠血清ALT、ALP活性和TG含量显著升高，ALB含量显著降低，提示氢化可的松造模药物本身就可能导致肾阳虚大鼠肝细胞损伤。给予补骨脂后，肾阳虚大鼠血清ALP活性和TG含量显著下降，ALT活性也逐渐下降，且趋于正常水平。而肾阴虚大鼠恰恰相反，给予补骨脂后，ALT、AST活性和TG的含量随着给药剂量的增加而不断升高，ALB和TP的含量随着给药剂量的增加而不断下降。
综上，补骨脂对不同证候模型大鼠肝脏功能的影响略有不同，尤其在ALT和ALB的影响方面，补骨脂表现出对肾阳虚动物的肝保护作用，而对肾阴虚大鼠随着用药剂量的增加损伤程度也逐步加强，且影响机制仍不是很明确，需进一步深入阐明。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：吴晓燕，赫俊杰，阎星旭，张芳芳，许妍妍，李遇伯． 基于“有故无殒”的补骨脂对不同肾虚证模型大鼠肝脏功能的影响 [J]. 中草药, 2023, 54(2):434-441.
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