导读
由于膳食多酚在预防和治疗代谢性疾病（如肥胖症和炎症性肠病（IBD））方面的突出生物活性，人们认为膳食多酚对人类健康具有重要影响。类黄酮是一类主要的多酚，广泛存在于植物、水果和蔬菜中的葡萄糖苷结合形式，而糖基团是决定结合糖苷的类黄酮在体内吸收、分布和代谢的关键因素。其中橙皮素-7-O-葡萄糖苷（Hes-7-G）是一种代表性的黄酮类单葡糖苷，可通过从橙皮苷中水解除去鼠李糖生成。本研究于此采用非靶向和靶向代谢组学以及16S rRNA基因测序来探索Hes-7-G的确切吸收位点及其在小鼠中的有益作用。基于1H核磁共振（NMR）的代谢组学筛选表明，Hes-7-G主要在小鼠小肠中代谢，尤其是回肠段。对小鼠肝脏、肠道、粪便和血清中胆汁酸（BAs）的定量分析表明，Hes-7-G的摄入加速了BAs的合成和排泄过程，从而促进了消化，降低了肝脏胆固醇和甘油三酯。16S rRNA基因测序显示，Hes-7-G显著提高了小鼠肠道微生物群的多样性，尤其是那些与BA次级代谢相关的细菌。这些结果表明，长期饮食Hes-7-G通过调节小鼠肠道细菌和BA代谢，对健康起到有益作用。
论文ID
原名：Multiomics Analyses Reveal That Long-Term Intake of Hesperetin-7‑O‑glucoside Modulates the Gut Microbiota and Bile Acid Metabolism in Mice
译名：代谢组学和肠道微生物组学分析显示，长期摄入橙皮素-7-O葡萄糖苷可调节小鼠肠道菌群和胆汁酸代谢
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：5.895
发表时间：2022.11
通讯作者：张利民
通讯作者单位：中国科学院精密测量科学与技术创新研究院
实验结果
1. 长期摄入Hes-7-G对小鼠生理状态的影响
饲粮喂养Hes-7-G 9周处理后，苏木精和伊红(H&E)染色以及阿利新蓝和过碘酸希夫（AB−PAS）染色显示，小鼠肝脏和结肠组织未见明显组织病理学变化，（支持信息的图S1）。然而，在分子水平上，我们通过临床化学分析观察发现，膳食Hes-7-G显著降低了小鼠血清中尿素氮（UREA）、总胆红素（TBIL）和低密度脂蛋白（LDL）的水平（支持信息表S3）。
图1 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）评分（左）和相应的载荷（右）图，这些模型来源于对照组和Hes-7-G处理小鼠的肠段（如（A）十二指肠、（B）空肠和（C）回肠）的1H NMR数据。
图S1 （A）对照组和Hes-7-G组的H&E染色肝脏、H&E和（B）AB-PAS染色结肠的代表性组织病理切片。（C）杯状细胞的数量和粘液层的厚度。数据显示为平均值±标准差。
2. 长期摄入Hes-7-G对肠道代谢谱的影响
我们首次进行了基于1H NMR的非靶向代谢组学研究，以探讨长期食用Hes-7-G后小鼠肠道（包括十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）的代谢变化。支持信息的表S5和图S2显示了小鼠的核磁共振信号（包括十二指肠、空肠和回肠）的鉴定结果。我们还使用从1H NMR数据归一化产生的配对OPLS-DA模型以及颜色编码的载荷图来提取两个比较组之间的差异代谢产物（图1）。同时，OPLS-DA和PLS-DA模型分别通过CV-ANOVA值和置换检验进行交叉验证（支持信息表S4）。与对照组相比，食用Hes-7-G的小鼠十二指肠中的乳酸、丙氨酸和牛磺酸水平显著较高（图1A），空肠和回肠中的乳酸、肌酸、牛磺酸和腺苷水平显著较低，支链氨基酸（BCAAs），苯丙氨酸和酪氨酸水平较高（图1的B和C部分）。值得注意的是，Hes-7-G组回肠中BAs的显著上调（图1C）。此外，与对照小鼠相比，食用Hes-7-G后，小鼠盲肠和结肠提取物中的代谢组没有显著变化。从肠道获得的这些代谢结果与交叉验证的多变量统计模型的参数一致（支持信息的表S2），这表明，从十二指肠、空肠和回肠的核磁共振数据生成的模型是成功的，而盲肠和结肠的模型在统计上是无显著性差异。总之，这些代谢结果表明，长期摄入Hes-7-G的影响主要集中在小肠段，包括十二指肠、空肠和回肠。
图2 超高效液相色谱联用三重四极杆质谱（UPLC −QQQ−MS）靶向分析对照组和Hes-7-G处理小鼠的（A和B）肝脏、（C和D）回肠、（E和F）粪便和（G和H）血清中的胆汁酸（包括未结合和结合的BAs）。数据以平均值±SD表示。通过双尾学生t检验，(∗) p < 0.05，(∗∗) p < 0.01，且(∗∗∗) p < 0.001。
图S2 包括小鼠十二指肠、空肠和回肠在内的多个生物样品的代表性600 MHz 1H NMR波谱。表S5中列出了与代谢物有关的关键信息。
3. 长期摄入Hes-7-G对BA代谢的影响
我们用HPLC− QQQ−MS对BAs进行靶向成分定量揭示膳食Hes-7-G诱导小鼠肝脏中牛磺胆酸（TCA）、牛磺脱氧胆酸（TDCA）、β-鼠胆酸（β-MCA）和脱氧胆酸（DCA）的显著上调（图2的A和B部分）。在喂食Hes-7-G的小鼠的回肠中，我们还观察到未结合的BAs（包括β-MCA、胆酸（CA）、DCA、nutri-CA和12-酮DCA）和结合BAs（例如牛磺酰基-α-鼠胆酸（T-α-MCA））、牛磺酰基β-鼠胆酸（T-β-MCA），牛磺脱氧胆酸（TUDCA）、TCA和甘氨胆酸（GCA）的显著上调（图2的C和D）。在小鼠粪便中，膳食Hes-7-G显著增加了未结合BAs的水平，如ω-鼠胆酸（ω-MCA）、DCA和石胆酸（LCA）（图2E），并降低了猪胆酸（HCA）和nutri-CA，而不改变结合BAs（图2F）。在血清中，α-MCA和β-MCA的水平显著下调（图2G），而那些结合的BAs在饮食摄入Hes-7-G后在小鼠中保持不变（图2H）。除了血清中LDL和UREA显著降低外，肝脏总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平也降低（图3A）。在小鼠肝脏中，膳食Hes-7-G显著上调Cyp7a1、Cyp27a1和Cyp7b1的mRNA水平（图3B），它们是编码BAs合成途径中涉及的酶，mRNA Fxr的显著调节（图3B，BA合成的负反馈调节因子）证实了这一结果。在小鼠回肠中，Hes-7-G显著下调Fgf15的mRNA水平并上调Tgr5表达，而Fxr的mRNA水平没有显著变化（图3C）。总之，这些观察结果表明，膳食Hes-7-G促进BAs的合成、转运和分泌，对重吸收没有显著影响。
图3 （A）对照组和Hes-7-G处理小鼠的血清和肝脏生化参数，如LDL、UREA、TC和TG，（B）肝脏中Fxr、Cyp7a1、Cyp27a1和Cyp7b1的mRNA水平，以及（C）回肠中Fxr，Fgf15和Tgr5的mRNA水平。数据以平均值±SD表示。通过双尾学生t检验，(∗) p < 0.05，(∗∗) p < 0.01，且(∗∗∗) p < 0.001。
4. 长期摄入Hes-7-G对肠道菌群的影响
鉴于通过饮食进行的长期Hes-7-G处理直接接触肠道微生物环境，我们接下来尝试研究Hes-7-G对肠道微生物组的调节。微生物多样性分析表明，膳食Hes-7-G诱导小鼠肠道微生物群中α-多样性指数的显著上调，包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson（图4A）。β多样性的主坐标分析（PCoA）表明，膳食Hes-7-G导致小鼠肠道微生物群的全部种群发生显著变化（图4B）。在门水平上，厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、脱硫杆菌门和疣微菌门是小鼠的优势细菌（图4C），其中通过Hes-7-G处理，厚壁菌门和拟杆菌门的水平分别显著下调和上调（图4的D和E部分），导致厚壁菌/拟杆菌门比例显著降低（图4F）。作为重要的微生物产物，在食用Hes-7-G 9周后，小鼠粪便中的短链脂肪酸（SCFAs），特别是乙酸和丁酸显著升高（图4G）。在属水平上，饮食摄入Hes-7-G导致梭菌、Muribaculaceae、真杆菌、瘤胃球菌、Lachnoclostridium、苏黎世杆菌、大肠埃希菌、红蝽菌、脱硫弧菌和Rikenellaceae丰度显著上调（图5的A−J），以及Gastranaerophilales丰度下调（图5L），其中一些细菌通过肠内的相互作用参与BA代谢。此外，长期摄入Hes-7-G也在一定程度上上调了乳酸杆菌的相对丰度（图5K）。
图4 对照组和Hes-7-G处理小鼠的微生物群落特征
（A）α-Chao1、ACE、Shannon和Simpson的多样性指数，（B）β多样性的PCoA，（C）门水平肠道细菌的相对丰度，（D）厚壁菌门（Firmicutes）、（E）拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度和（F）它们在小鼠盲肠内容物中的比例，以及（G）粪便中SCFAs的定量。数据以平均值±SD表示。通过双尾学生t检验，(∗) p < 0.05，(∗∗) p < 0.01，且(∗∗∗) p < 0.001。
5. Hes-7-G处理后肠道菌群与BA代谢产物的关系
为了进一步探讨饮食Hes-7-G诱导的肠道微生物群变化与BA代谢之间的关系，我们通过计算Pearson相关系数进行了Spearman秩相关分析（图6）。由此得出的相关热图表明，大多数肝脏BAs与红蝽菌科呈正相关。特别是，肝脏中的β-MCA与大多数观察到的肠道细菌表现出最强的正相关（图6A）。许多回肠BAs大多与梭状芽孢杆菌属呈正相关（图6B）。在小鼠粪便中，主要是次级BAs，如LCA和DCA，与脱硫弧菌、红蝽菌科、梭状芽孢杆菌和Rikenellacea呈正相关，与HCA呈负相关（图6C）。在小鼠血清中，TDCA、TCA和TUDCA的水平与真杆菌属呈正相关。值得注意的是，我们发现脱硫弧菌属与许多BA代谢产物呈正相关，包括TDCA、T-α-MCA、HDCA、CDCA和DCA。此外，梭菌属与小鼠血清中的DCA、β-MCA和α-MCA呈负相关（图6D）。这些发现表明，膳食Hes-7-G调节了肠道微生物群和BA代谢产物之间的相互作用，特别是肝脏和回肠BAs。
图5（A−L）对照组和Hes-7-G处理小鼠盲肠内容物中属水平微生物群类群的相对丰度。数据以平均值±SD表示。通过双尾学生t检验，(∗) p < 0.05，(∗∗) p < 0.01，且(∗∗∗) p < 0.001。
图6 胆汁酸和肠道微生物群之间的Spearman秩相关分析。根据Spearman的秩相关系数，(∗) p < 0.05，(∗∗) p < 0.01，且(∗∗∗) p < 0.001。
讨论
类黄酮作为膳食多酚的重要成分，主要以类黄酮苷的形式存在于植物中。糖基部分是决定其吸收、代谢和生物活性的关键因素。Hes-7-G是由橙皮苷去除鼠李糖水解而成的一种黄酮单葡萄糖苷，其中橙皮苷为陈皮（CRP）的主要成分。因此，其吸收特性和生物利用度与橙皮苷有很大不同。以往大多数研究主要集中在橙皮苷的吸收、代谢、生物利用度和生物活性；然而，由于Hes-7-G在植物中的含量相对较低，因此很少有研究调查或评估长期膳食摄入Hes-7-G的吸收和生物活性。我们使用代谢组学、宏基因组学和生物测定的组合，本研究发现，长期饮食摄入Hes-7-G可显著调节小鼠肠道吸收后的肠道微生物群和BA代谢。
众所周知，小肠是一个重要的消化器官，由于其“刷状缘”结构，在食物加工和营养吸收中发挥着关键作用。通常，类黄酮苷在结肠中被吸收，而类黄酮单糖苷在小肠中被吸收。小肠可分为四个部分，包括十二指肠、空肠、回肠和盲肠，具有不同的结构和功能。在此，基于1H NMR的肠代谢组学的结果表明，Hes-7-G的长期摄入导致小鼠不同肠段的代谢谱发生不同变化，这表明小肠，尤其是空肠和回肠中内源性代谢产物的变化最为显著，这一点通过交叉验证模型得到了进一步证实。这些结果表明Hes-7-G主要在小鼠的空肠和回肠段被吸收和代谢。具体而言，内源性代谢产物（包括牛磺酸、磷酸胆碱、肌酸和乳酸）的显著下调，以及一些氨基酸（如BCAA、苯丙氨酸和酪氨酸）在空肠和回肠中的上调，表明长期膳食摄入Hes-7-G提供了额外的营养素，并维持了细胞膜结构和渗透压。特别值得注意的是，长期摄入Hes-7-G后，我们在小鼠回肠中也观察到BAs水平的显著升高，这意味着它可能调节涉及BA代谢和微生物生态环境的肠肝循环。
BAs在通过与生理和病理条件密切相关的肠肝循环介导宿主脂质和葡萄糖稳态中发挥重要作用。在肠肝循环中，BA代谢包括几个过程，包括合成、运输、重吸收和排泄，涉及不同器官。在这项研究中，BAs的显著上调以及肝脏中TC的显著降低表明，长期膳食摄入Hes-7-G促进了BA在肝脏中的生物合成和积累，这一点通过肝脏Cyp7a1、Cyp27a1和Cyp7b1的mRNA水平显著升高得到进一步证实，这几个是BAs经典和替代生物合成途径的关键酶。mRNA Fxr（BA合成的负反馈调节因子）的显著调节进一步支持了上述观点。小鼠回肠和粪便中BAs的显著升高，伴随着回肠中Fgf15 mRNA水平的下调和Tgr5表达的上调，表明膳食摄入Hes-7-G促进BAs的转运和分泌。然而，血清BAs水平没有显著变化，这表明膳食摄入Hes-7-G对BAs的再吸收没有显著影响。此外，Hes-7-G处理显著降低了小鼠血清LDL和肝脏TG的水平，提示Hes-7-G可能有益于脂质代谢，因为低密度脂蛋白和甘油三酯的积累与许多代谢疾病，如肥胖症和动脉粥样硬化高度相关。
大量研究表明，膳食黄酮和纤维可以通过调节肠道微生物群有效改善代谢疾病。这里，微生物多样性的显著上调和厚壁菌门/拟杆菌门比率的下调表明，长期摄入Hes-7-G显著影响肠道微生物群落。据报道，与肥胖者相比，瘦弱个体的肠道中厚壁菌门/拟杆菌门比例相对较低，因此被视为减肥效果的指标。这一结果表明，长期摄入Hes-7-G可能通过调节肠道微生物群对减肥产生潜在影响。Hes-7-G处理显著提高了梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、Muribaculaceae、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、真杆菌属（Eubacterum）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、Lachnocosteridium、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、大肠埃希菌（Colidextribacter）、红蝽菌，脱硫弧菌，以及理研菌，据报道，其中一些对宿主健康有益。具体而言，梭状芽孢杆菌属和乳杆菌属对调节宿主代谢和免疫系统具有显著作用，尤其是通过产生色氨酸代谢产物和SCFAs来保持肠道屏障功能完整性和显示抗炎活性的能力。在这里，饮食中的Hes-7-G显著增加了小鼠的粪便SCFAs，这表明Hes-7-G促进了肠道微生物群的发酵过程，从而为身体提供能量。作为啮齿类动物拟杆菌门中的一大部分细菌，Muribaculaceae在复杂的碳水化合物降解方面具有多样性。此前的一项研究报告称，高脂肪饮食显著降低了Muribaculaceae的丰度，显示出与小鼠体重的显著负相关。结合血清LDL和肝脏TG的显著降低，这些结果表明膳食摄入Hes-7-G通过调节肠道微生物群在降脂方面具有潜在作用。
结论
越来越多的证据表明，肠道微生物群和BAs之间的相互作用对调节宿主能量收获、脂质代谢和胆固醇稳态具有关键作用。据报道，拟杆菌属、梭状芽胞杆菌属、乳酸菌属、双歧杆菌属和李斯特菌属与胆盐水解酶（BSH）的酶活性高度相关，其中BSH在回肠末端具有很强的解耦合能力，可使结合BAs转化成各自的游离BAs。此外，拟杆菌、梭状芽孢杆菌、瘤胃球菌和真杆菌主要参与肠内BAs的差向异构化、7-脱羟基化、酯化和脱硫。在目前的研究中，小鼠肠道中的梭状芽孢杆菌、Muribaculaceae、真杆菌和瘤胃球菌科显著上调，这表明饮食中的Hes-7-G可能会脱偶联、7α-脱羟基化，并将初级BAs向次级BAs差向异构化。此外，我们发现这些细菌与多种生物样本中的BAs高度相关，如肝脏、回肠、粪便和血清。因此，粪便中ω-MCA、DCA和LCA水平以及回肠中β-MCA、CA、T-β-MCA和TCA水平的显著升高，以及血清中α-MCA和β-MCA的下调进一步证实了Hes-7-G介导了肠道微生物群和BA产生之间的相互作用，并最终影响了宿主的生理状态。Hes-7-G显著调节微生物群和BAs之间的相互作用，从而显示出预防或治疗某些代谢疾病的潜力。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.2c05053
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