乌梅始载于《神农本草经》[1]，是一种常见的药食同源的中药，《中国药典》2020年版中规定其为蔷薇科杏属植物梅Prunus mume (Sieb.) Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果实，具有敛肺、涩肠、生津、安蛔的功效，常用于治疗肺虚久咳、久泻久痢、虚热消渴、蛔厥、呕吐、腹痛等症[2]。现代药理学研究表明，乌梅具有抑菌、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抑制肾结石等作用[3-5]。
宋代《证类本草》[6]中最早提及乌梅炭“烧为末，杵末”。《汤液本草》[7]中记载乌梅“治一切恶疮肉出，以乌梅烧为末，杵末傅”。乌梅及乌梅炭应用历史悠久，临床应用中，乌梅具有涩肠止泻的功效，乌梅炭新增止血功效。炭药是一类非常具有炮制特色的中药，具有广泛的药理作用，止血作用是其共性。炭药首次记载于战国时期的《五十二病方》“止出血者燔发”[8]。关于炭药止血理论，学说众多，通常认为中药经炒炭炮制后，化学成分组成及含量发生了改变，从而产生止血作用[9]。张向阳等[10]研究发现地榆炭发挥止血作用可能与其鞣质含量相关。钟凌云等[11]认为炭药止血作用是因为高温炮制后中药中的草酸钙或碳酸钙分解，可溶性钙盐含量升高，从而促进血液中的蛋白质凝固，激活凝血因子，产生凝血效果。随着中药炭药中纳米类成分碳点的研究逐渐兴起，研究发现，碳点存在于多种炭药中并产生止血作用[12-13]，Cheng等[14]发现灯心草经炭烧处理后在其水提物可产生灯芯炭纳米碳点，可抑制血小板的减少和局部出血。
为探究乌梅及乌梅炭化学成分及药理作用的差异，阐明乌梅炒炭止血的科学内涵，本实验首先采用液质联用技术初步鉴定乌梅及乌梅炭水煎液中的化学成分，经偏最小二乘法统计分析可视化展示乌梅及乌梅炭水煎液化学成分的组间差异并明确了6个差异成分，然而小分子化合物的变化无法充分阐明乌梅炒炭止血的科学内涵。其次，以小鼠肠推进实验和断尾出血实验分别评价乌梅及乌梅炭的涩肠与止血作用，结果显示乌梅和乌梅炭均有涩肠作用，乌梅炒炭后产生了止血作用，且止血活性部位为乌梅炭透析袋内相对分子质量较大的成分。最后，采用低分辨透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）、红外光谱等技术对乌梅炭止血活性部位进行初步结构表征，从相对分子质量大的化合物角度为乌梅炒炭止血的原理提供新的视角。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Thermo Scientific Q Exactive型质谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；FA1104型电子天平，上海乐平科学仪器有限公司；HH-S6A型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；SHB-IIIA型循环水式多用真空泵，上海振捷试验设备有限公司；Thermo Scientific Nicolet Is10型傅里叶红外光谱仪、Tecnai G2 20型TEM，美国FEI公司。
1.2 材料
乙腈（色谱纯，批号F22M8G206）购自美国Fisher公司；甲酸（色谱纯，批号214911）购自赛默飞世尔科技有限公司；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；注射用白眉蛇毒凝血酶，购自锦州奥鸿药业有限责任公司；蒙脱石散，购自海南先声药业有限公司；0.9%氯化钠注射液（批号1709283205）购自石家庄四药有限公司；水合氯醛（批号20210915）购自上海麦克林生化科技有限公司）、墨水、透析袋（截留相对分子质量1000）购自北京正程生物科技有限公司；注射用白眉蛇毒血凝酶（hemocoagulase for injector，HI）购自北京正程生物科技有限公司。
共收集6批乌梅样品（MF1～MF6），经北京中医药大学李向日教授鉴定为蔷薇科杏属植物梅P. mume (Sieb.) Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果实，乌梅饮片信息见表1。6批乌梅样品（MF1～MF6）在150～180℃下清炒50 min，至乌梅皮肉鼓起，表面焦黑色为止，即得乌梅炭样品（MFC1～MFC6）。乌梅及乌梅炭样品如图1所示。
1.3 实验动物
SPF级KM小鼠，5周龄60只，4周龄60只，购自斯贝福（北京）生物技有限公司，实验动物生产许可证号SYXK（京）2016-0038，饲养于北京中医药大学实验动物中心，室温22～25 ℃，相对湿度60%，12 h/12 h昼夜循环，本实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准。
2 方法与结果
2.1 乌梅水煎液和乌梅炭水煎液的制备
取乌梅饮片20.0 g，分别以40倍量水煎煮3次，每次1 h。每次的煎煮液皆用滤纸滤过，合并煎煮液，浓缩成1.0 g/mL（按照生药量计算），即得乌梅水煎液。于4 ℃冰箱，保存备用。
将乌梅炭饮片20.0 g，同法制成乌梅炭水煎液。于4 ℃冰箱，保存备用。
将乌梅炭水煎液置于透析袋（截留相对分子质量1000）内透析，每隔一段时间换1次水，直至透析袋外溶液无色，收集每次换取的袋外溶液，浓缩至1.0 g/mL（按照炭药量计算），得到乌梅炭透析袋外溶液（MFC-O）；同时收集透析袋内溶液，浓缩至1.0 g/mL（按照炭药量计算），得到乌梅炭透析袋内溶液（MFC-I）；MFC-O和MFC-I均放于4 ℃冰箱中，保存备用。
2.2 液质联用（LC-MS）分析
2.2.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；样品室温度15 ℃；进样量3 μL；以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱：0～6 min，3%～15%甲醇；6～20 min，15%～30%甲醇；20～27 min，30%～95%甲醇；27～28 min，95%～3%甲醇；28～30 min，3%甲醇；体积流量为0.2 mL/min。
2.2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），负离子模式扫描，毛细管温度350 ℃，鞘气和辅助气均为氮气（质量分数＞99%），鞘气流速35 arb，辅助气流速10 arb，喷雾电压3200 V，最大喷射电流100 A，扫描范围为m/z100～1500，数据采集系统为Xcalibur 4.1。
2.3 成分解析
使用Xcalibur 4.1与MZmine-2.53-Windows软件对质谱数据进行处理，通过查阅文献[15-18]和质谱相关网站，根据相关化合物的准分子离子峰、二级碎片离子峰、离子峰丰度比等质谱信息，初步推测化合物结构。
乌梅及乌梅炭水煎液质谱总离子流图见图2，水煎液中初步鉴别出的化合物汇总见表2。
2.4 乌梅与乌梅炭化学成分正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）
乌梅和乌梅炭水煎液的质谱数据（Raw格式）通过QI软件进行标准化处理，处理后的数据以usp格式导入SIMCA 14.1软件进行多元统计分析。将乌梅和乌梅炭水煎液2组样品进行OPLS-DA，结果见图3，并绘制S-plot散点图以显示2组样品的差异性成分，结果见图4。
从OPLS-DA图（图3）中可以看出，乌梅和乌梅炭水煎液可明显分为2类，提示乌梅炮制后成分含量或组成发生了较大的变化。S-plot散点图（图4）表明二者之间存在6个显著差异性成分，分别为苯甲基-β-樱草糖苷（峰25）、枸橼酸（峰9）、柠檬酸-葡萄糖溶液（acid citrate dextrose，ACD，峰7）、番石榴酸（峰19）、3-羟基戊二酸（峰10）、2-O-阿魏酸-羟基柠檬酸（峰24），其中ACD具有抗凝作用[19-22]，且经炒炭炮制后含量降低。
2.5 小鼠肠推进实验
5周龄KM小鼠按体质量随机分为对照组、蒙脱石散组、MF组、MFC组、MFC-O组以及MFC-I组，每组6只。对照组将生理盐水与50%墨水1∶1混合，以2 g/kg的剂量给药。蒙脱石散组取1.75 g蒙脱石散用生理盐水稀释成17.5 mg/mL的溶液，与50%墨水1∶1混合，以0.5 g/kg的剂量给药。MF、MFC、MFC-O和MFC-I给药组将“2.1”项下溶液用生理盐水稀释，得到质量浓度为700 mg/mL（按原药材的质量计算）的溶液，与50%墨水1∶1混合，以2 g/kg的剂量单次给药。实验前12 h禁食，自由饮水。给药30 min后将各组小鼠以颈椎脱臼法处死。立即解剖取出上端自幽门，下端至回盲部的全部小肠肠管，用卷尺测量小肠肠道全长及墨汁在肠道内推进长度，依公式计算墨汁推进率。
墨汁推进率＝肠管染黑长度/小肠肠管总长度
实验结果如表3所示。与对照组相比，蒙脱石散、MFC组在涩肠作用方面具有显著性差异（P＜0.05），MF组在涩肠作用方面具有极显著性差异（P＜0.001）；MFC-I组和MFC-O组无显著性差异，但均有明显的下降趋势。说明乌梅炭的涩肠作用是透析袋内和透析袋外2部分成分共同发挥作用的。
2.6 小鼠断尾止血实验
4周龄KM小鼠按照体质量随机分为对照组、HI组、MF组、MFC组、MFC-O组以及MFC-I组，每组7只，其中对照组ig生理盐水，给药剂量0.5 mL/只。HI组用10 mL的生理盐水分次溶解1 kU HI粉末，配制成0.1 kU/mL的溶液，置于锡箔纸包裹的离心管中，给药剂量0.2 mL/只。MF、MFC、MFC-O以及MFC-I给药组：将“2.1”项下溶液用生理盐水稀释，得到质量浓度为100 mg/mL（按原药材的质量计算）的溶液，给药剂量0.5 mL/只，均为单次给药。给药方式为sc给药，给药2 h后，将小鼠用10%水合氯醛以0.01 g/g的剂量ip麻醉，平放于手术台上，用剪刀于距离小鼠1 cm尾尖处剪断，待血液开始自行溢出时计时，每30 s用滤纸吸附尾尖血滴1次，直至再无血液流出（即滤纸吸附时无血迹出现）。从断尾血液流出开始到出血时间停止，此段时间即为出血时间，记录实验结果。
从小鼠断尾血液开始流出到流血停止流出为出血时间，6组小鼠断尾出血时间记录如表4所示。与对照组相比，MF组小鼠断尾出血无显著的差异，HI组和MFC组的小鼠断尾出血时间明显缩短（P＜0.01），说明乌梅炒炭后产生了止血作用；而MF组和MFC-O组小鼠断尾出血时间无显著性差异，说明乌梅水煎液和乌梅炭透析袋外溶液并不能起到止血作用；MFC-I组小鼠断尾出血时间明显缩短（P＜0.01），说明乌梅炭止血作用的活性部位是透析袋内大分子成分。
2.7 乌梅炭透析袋内成分的结构表征
透析袋是由半透膜制成袋状容器，样品溶液在透析过程中相对分子质量较大的分子被截留在袋内，盐和小分子物质不断扩散并从袋中透析出来，直到袋内外的浓度达到平衡。小鼠断尾出血实验结果显示，乌梅炭止血作用的活性部位主要为透析袋内相对分子质量较大的成分，故而对乌梅炭透析袋内成分进行结构表征。
2.7.1 TEM分析 以去离子水为溶剂，将制备的MFC-I溶液稀释成一定质量浓度，超声30 min，用0.22 μm微孔滤膜滤过。将获取的MFC-I溶液滴于铜网上，阴干后利用TEM分析。由图5可以看出，MFC-I中分布着外形近球形的颗粒，在水中具有良好的分散度，粒径小于5 nm。
2.7.2 红外光谱（FTIR）分析 电子分析天平称取溴化钾粉末100 mg；将1滴MFC-I与100 mg溴化钾混合，烘干后碾磨成细粉，置于模具中压片。尽量避免样片长时间暴露于空气中，然后迅速放入红外测试仪的样品架中测定其FTIR。从图6可以看出，该部分的官能团吸收峰位于3 425.09、2 969.93、2 925.04、2 854.41、1 734.89、1 617.59、1 410.23、1 086.54、1 049.90、880.93 cm−1等。通过分析可知，波数为3 425.09 cm−1的吸收峰，是-OH或-NH的伸缩振动峰，与分子间氢键的伸缩振动相关；波数为2 925.04、2 854.41 cm−1的吸收峰与-CH3和-CH2的对称和不对称伸缩有关；波数为1 734.89 cm−1由 C＝O的伸缩振动引起；波数为1 617.59 cm−1吸收峰由C＝C的伸缩振动引起，波数在1010～667 cm−1的为C＝H的面外弯曲振动引起。同时在1650～1430 cm−1区域内只存在1 617.59 cm−1 1个吸收峰，故推测MFC-I中的成分不含苯环。综上MFC-I的表面活性基团主要以C＝O、-OH或-NH以及C＝C为主。
3 讨论
乌梅性平，味酸涩，具有敛肺、涩肠、生津、安蛔的功效，炒炭后产生了止血的功效[23]。通过对乌梅和乌梅炭水煎液中的化学成分进行解析，可以看出乌梅中多数成分为有机酸类化合物，符合乌梅味酸涩的特点。对比乌梅与乌梅炭水煎液的化学成分可以发现，赤藓糖醇、2′-脱氧肌苷、柚皮素等成分在乌梅炭水煎液中并未检识到，推测可能在炒制的过程中发生了分解和转化。
小鼠肠推进实验表明，乌梅与乌梅炭均具有涩肠作用。MFC-I溶液和MFC-O溶液与MFC组相比无显著差异，但仍有涩肠作用，说明乌梅炭的涩肠作用是由透析袋内和透析袋外2部分共同组成。液质数据分析乌梅炒炭前后化学成分的变化，发现乌梅与乌梅炭有机酸化合物基本一致，推测这些化合物是乌梅与乌梅炭涩肠作用的共同物质基础。
小鼠断尾出血实验表明，乌梅本身并没有止血作用，炒炭后产生了止血作用，乌梅炭止血作用的活性部位主要是乌梅炭透析袋内成分。乌梅炭水煎液经由透析袋透析，相对分子质量较大的分子被截留在袋中，对乌梅炭透析袋内成分进行结构表征，发现其在TEM下为粒径小于5 nm的近球形颗粒，在水中分散度良好。FTIR显示，乌梅炭透析袋内成分的表面活性基团主要以C＝O、-OH或-NH以及C＝C为主，且不含苯环。由此推测乌梅炒炭后可能产生了某些相对分子质量较大的物质，该物质具有止血作用。此外，液质数据分析发现，乌梅中具有抗凝作用的化合物ACD在炒炭后含量降低，从而导致乌梅炭抗凝作用减弱，这也可能是乌梅炭产生止血作用的原因之一。
以上实验结果说明了乌梅炒炭前后化学成分和药理作用的变化，对乌梅炭止血作用的有效部位，即透析袋内的相对分子质量较大的化合物，进行了初步的结构表征，为乌梅炒炭止血理论提供新的研究思路。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：李春帅，辛洁萍，王海丽，徐文娟，宋肖桦，叶先文，张海霞，李 千，李向日．乌梅炒炭前后化学成分与药效变化及其炒炭止血原理研究 [J]. 中草药, 2022, 53(24):7714-7720.
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