导读
细胞外DNA陷阱(ETS)代表一种免疫反应，细胞通过这种反应释放染色质和颗粒蛋白等基本物质。以往的研究表明，血管平滑肌细胞(VSMCs)的转分化在动脉粥样硬化中起着关键作用。本研究旨在探讨CD68+VSMCs与ETS形成的相互作用，并探讨其在动脉粥样硬化中的作用。在这里，我们显示了ETS被抑制，动脉粥样硬化斑块的形成减轻了雄性Myh11CrePad4flox/FLOX小鼠经腺相关病毒-8(AAV8)介导的原蛋白转换酶枯草杆菌/可信9型突变(PCSK9)的过度表达和高脂饮食的挑战。体外培养的CD68+VSMCs产生明显的ETS，可被Cl2+和DNase I抑制。利用VSMCs谱系追踪技术和单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，我们证明CD68+VSMCs中的ETs通过STING-SOCS1或TLR4信号通路调节VSMCs转分化的方向，从而影响动脉粥样硬化的进展。
论文ID
题目：Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis
译名：激活的血管平滑肌细胞的胞外陷阱推动动脉粥样硬化的进展
期刊：Nature Communications
IF：17.694
发表时间：2022.12.6
通讯作者单位:同济大学
DOI号：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35330-1
主要内容
细胞外DNA陷阱(ETS)是细胞将DNA释放到细胞外空间，形成由解聚的染色质、瓜氨酸化组蛋白和细胞蛋白组成的网状结构的先天免疫反应。通常情况下，ETS被认为可以固定和杀死微生物。ETS的形成最先是由Brinkmann等人在中性粒细胞中发现的，被称为中性粒细胞外陷阱(Nets)，被认为是消除微生物的一种有效的防御反应。除了中性粒细胞，其他髓系细胞，包括巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，已经被证明在不同的疾病中产生ETS结构，包括动脉粥样硬化。
在本研究中，我们首次发现CD68+VSMCs在动脉粥样硬化危险因素的作用下被激活，并产生ETS，通过影响晚期斑块的微环境而促进斑块的进展。Megens等人首次报道在小鼠和人类的动脉粥样硬化病变中存在Net。从那时起，多项研究表明，Net不仅参与动脉粥样硬化，而且还能促进凝血和促进血栓形成。我们证实了先前研究的结果，即Net在小鼠动脉粥样硬化病变的早期阶段出现。然而，我们的实验进一步证明，甲硫氨酸在晚期斑块中更占优势，这是一个网状病毒比例下降的时间框架。事实上，巨噬细胞在免疫细胞中占主导地位，而中性粒细胞在晚期动脉粥样硬化病变中很少见。因此，除了正常的髓系巨噬细胞外，CD68+的VSMCs是病变中存在的主要炎症细胞。这些结果与Pertiwi，K.R等人的发现一致，他们发现在有脂质核心的完整斑块中，Met比Net更多。此外，我们的VSMCs谱系追踪结果证实，来源于CD68+细胞的ETS在晚期斑块中起主导作用。
在动脉粥样硬化斑块的形成过程中，中性粒细胞胞外陷阱(Net)或巨噬细胞胞外陷阱(Met)以时间依赖的方式产生
只有少数研究评估了CD68+细胞产生的ETS在慢性疾病中的作用。虽然先前的研究表明PMA或细菌对小鼠巨噬细胞不能诱导ETS，但我们观察到CD68+VSMCs在氧化低密度脂蛋白刺激下产生ETS，提示CD68+VSMCs在体外也能形成ETS。在中性粒细胞和巨噬细胞中，弹性蛋白酶和MPO都有助于ETS的形成。ETS的形态特征通常与其功能有关。例如，来自髓系细胞的ETS被展示为带有MPO和弹性蛋白酶的网状纤维，并与“捕获”和杀死微生物的能力相一致。然而，ETS从CD68+的VSMC延伸到邻近的SMC，表明它们倾向于在斑块内造成慢性损伤。此外，我们还发现CD68+VSMCs的ETS仅被H3CIT染色，而没有MPO和NE，而Net却能被三种经典的ETS标记所染色。
PAD4主要在中性粒细胞等造血细胞中表达。通常，组蛋白依赖于PAD4的瓜氨酸化会导致DNA去缩合。我们的scRNA-seq和体外实验表明，当VSMCs去分化为中间SMC时，PAD4的表达变化不明显，除非中间VSMC激活为CD68+VSMC。然而，PAD家族中的其他基因在VSMCs激活后变化不大。当PAD4在VSMC中被特异性敲除后，我们发现进展期斑块内ETS显著减少，同时促炎CD68+VSMC减少。这些结果提示CD68+VSMCs的ETS依赖于PAD4，在VSMCs激活促炎状态中起关键作用。利用scRNA-seq分析抑制ETS释放后SMC命运的特异性变化，结果显示抑制ETS可降低VSMCs中有害细胞的比例，增加有益细胞的比例，说明CD68+VSMCs中的ETS参与了VSMCs转分化过程中的平衡。
在晚期动脉粥样硬化斑块中，ET抑制减少CD68+VSMCs和scRNA-seq鉴定的多种VSMCs来源的细胞类型
我们的结果表明，CD68+VSMCs产生的ETS将激活VSMCs内的STINSOCS1信号通路，从而抑制STAT3的磷酸化，这与先前报道的DNA诱导的损伤是一致的。STAT3促进VSMCs收缩基因表达、增殖及抑制VSMCs凋亡。此外，据报道，STAT3通过其磷酸化参与胶原的生成和胶原纤维的形成，从而在斑块稳定中发挥关键作用。此外，TLR4-MYD88信号通路也被ETS激活，并诱导了促炎或衰老的表型变化，如MMP9、Gsdmd或TNF的表达增加，并诱导胶原降解和斑块不稳定性。此外，在我们的scRNA-seq结果和斑块中可以观察到由TLR4激活42引起的CD68+VSMCs的增殖，这表明pad4(Hi)CD68+SMC具有维持其数量的潜力，并介导促炎症的正反馈，从而促进动脉粥样硬化斑块负荷。
机制图：PAD4(Hi)CD68+VSMC可通过释放ETS激活周围VSMC
总结
这些中间细胞曾被认为是动脉粥样硬化的治疗靶点。但先前的研究结合我们的结果证实了VSMCs来源的中间细胞是多能的，可以分化为有害或有益的细胞。这些结果提示，VSMCs来源的中间细胞有利于病变的稳定性，抑制VSMCs向中间细胞的去分化可能是不恰当的。我们的研究表明，PAD4(Hi)CD68+VSMCs可以通过释放ETS，激活STING-SOCS1或TLR4信号通路而影响周围的VSMCs。ETS调节VSMCs由益样细胞向有害样细胞转分化的方向，并介导促炎的正反馈。这些结果表明，阻断ETS的正反馈更有价值，并确立CD68+VSMCs作为动脉粥样硬化更合适的治疗靶点。总之，我们的研究表明，CD68+VSMCs产生的ETS对斑块进展有负面影响，并强调了它们在斑块稳定性中意想不到的作用。这些发现也为VSMCs转分化为不同的中间、有害和有益的亚型提供了见解，这些亚型可能影响斑块的组成，并成为斑块预防的新的治疗靶点。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41467-022-35330-1
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